豆甲泰，劉友昊，梁?jiǎn)⒊?，吳宜艷 （. 牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，黑龍江 牡丹江 570；2. 陸軍第78集團(tuán)軍醫(yī)院，牡丹江 570；. 牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，牡丹江 570）

血紅鉚釘菇[Chroogomphus rutilus(Schaeff.)O.?. Mill.]，屬擔(dān)子菌亞門(mén)傘菌目鉚釘菇科鉚釘菇屬[1]。菌體鉚釘狀且菌肉為酒紅色，故名血紅鉚釘菇。分布于中國(guó)北方及西南多省，以及日本、歐洲及北美多國(guó)，主要生于松林中地上的雜草叢林之間，是一種與油松、樟子松、馬尾松、赤松共生的外生菌根真菌，群生、散生或單生，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，深受人們喜愛(ài)[2]。研究表明，血紅鉚釘菇富含蛋白質(zhì)、多糖、黃酮、香豆素及甾醇[3-8]等多種活性物質(zhì)，具有極高的食用和藥用價(jià)值。隨著人民生活水平的提高和科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，糖化學(xué)及其活性研究正在經(jīng)歷著飛速的發(fā)展，越來(lái)越多的動(dòng)物多糖、植物多糖、真菌多糖被開(kāi)發(fā)利用。多糖作為食用菌重要的活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、降血糖、降血脂[9-13]等諸多藥理作用。目前，各類(lèi)真菌多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究已廣泛開(kāi)展[14-23]。然而，迄今關(guān)于血紅鉚釘菇多糖開(kāi)發(fā)的研究較少，對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用的研究報(bào)道亦少，本文探討血紅鉚釘菇多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性、免疫調(diào)節(jié)因子釋放、NF-κB信號(hào)通路激活等一系列的免疫調(diào)節(jié)作用，以期為血紅鉚釘菇進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，儲(chǔ)藏于牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心-80 ℃冰箱中，經(jīng)復(fù)蘇后，置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.1.2 血紅鉚釘菇多糖

血紅鉚釘菇經(jīng)25%乙醇沉淀后，通過(guò)DEAE-52纖維柱洗脫出多糖組分CRPS25-Ⅱ，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要儀器

κZ-II勻漿儀（Servicebio）；κZ-II酶標(biāo)儀（Rayto）；D3024R臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)、D1008E臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（DRAGONLAB）；Stepone plus熒光定量PCR儀（ABI）；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰）；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（Thermo）；G0203-150G化學(xué)發(fā)光儀（CLINX）；FBZ2001-up-p標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）。

1.3 試劑及耗材

RNA提取液(批號(hào)：G3013)、引物、RIPA裂解液(批號(hào)：G2002)、PMSF(100mM，批號(hào)：G2008)、磷酸化蛋白酶抑制劑(批號(hào)：G2007)、β-肌動(dòng)蛋白(批號(hào)：GB12001)、GAPDH(批號(hào)：GB12002)、Histone H3(批號(hào)：GB11026)、HRP標(biāo)記山羊抗兔(批號(hào)：GB23303)、HRP標(biāo)記驢抗山羊(批號(hào)：GB23404)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠(批號(hào)：GB23301)、HRP標(biāo)記山羊抗大鼠(批號(hào)：GB23302)、轉(zhuǎn)移緩沖液(批號(hào)：G2017)、電泳緩沖液(批號(hào)：G2018)、TBS緩沖液(批號(hào)：G0001-2L)均購(gòu)自Servicebio公司；三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)血紅鉚釘菇多糖對(duì)淋巴細(xì)胞存活率的影響

收集對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，RAW264.7細(xì) 胞 以1×106個(gè) 細(xì) 胞/孔 接 種 于96孔板中，隨后，置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)24 h（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充），培養(yǎng)完成后去除原有培養(yǎng)基，加入濃度梯度分別為25、50、100、200、400 μg/ml的血紅鉚釘菇多糖溶液（各設(shè)置6個(gè)復(fù)孔）于恒溫箱中培養(yǎng)12 h。棄去孔內(nèi)原有培養(yǎng)液，每孔加入配制好的MTT溶液20 μl，連續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去原有MTT溶液。每孔加入150 μl DMSO，于恒溫箱中孵育10 min后，用錫紙包裹避光，操作輕盈防震，使結(jié)晶物充分溶解。孵育完成后，置于490 nm處測(cè)定吸光度（A）值。計(jì)算細(xì)胞增殖活力：細(xì)胞增殖活力=[(試驗(yàn)組OD均值－對(duì)照組OD均值)/ 對(duì)照組OD均值]×100%。實(shí)驗(yàn)表明血紅鉚釘菇多糖CRPS25-Ⅱ在25～400 μg/ml的范圍內(nèi)無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，見(jiàn)圖1。

圖1 血紅鉚釘菇多糖對(duì)巨噬細(xì)胞毒性的影響

2.2 RT-PCR方法測(cè)定血紅鉚釘菇多糖對(duì)IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平的影響

2.2.1 總RNA抽提

收集對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，隨后以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中，加入1 ml的DMEM完全培養(yǎng)基，并于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)24 h。設(shè)置不同濃度梯度的血色鉚釘菇多糖溶液1、20、40、80、160 μg/ml及空白對(duì)照組，于恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h。棄去原培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入1 ml的Trizol試劑（冰上操作）。12 000 r/min離心10 min取上清。加入250 μl三氯甲烷，顛倒離心管15 s，充分混勻，靜置3 min。4 ℃下12 000 r/min離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。-20 ℃放置15 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA。吸除液體，加入75%乙醇1.5 ml洗滌沉淀。4 ℃下12 000 r/min離心5 min。將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺(tái)上吹3 min。加入15 μl無(wú)RNA酶的水溶解RNA。55 ℃孵育5 min。使用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度及純度：儀器空白調(diào)零后取2.5 μl待測(cè)RNA溶液于檢測(cè)基座上，放下樣品臂，開(kāi)始吸光值檢測(cè)。將濃度過(guò)高的RNA進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋?zhuān)蛊浣K濃度為100～500 ng/μl。

2.2.2 反轉(zhuǎn)錄

取一PCR管，加入含10 μl RNA的溶液。加入0.5 μl Oligo (dT)18底物和0.5 μl隨機(jī)六聚體引物。用無(wú)核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至15 μl。于PCR儀上65 ℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻。依次加入4 μl×5反應(yīng)緩沖液，1 μl RT酶混合物，用移液器抽吸混勻。于PCR儀上42 ℃保溫60 min，結(jié)束后70 ℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

2.2.3 定量PCR

①取0.2 ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管：2×熒光定量PCR試劑10 μl；2.5 μmol/L基因引物2 μl；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl；雙蒸水6 μl。

②PCR擴(kuò)增：預(yù) 變 性95 ℃，10 min；循環(huán)（40次）95 ℃，15 s→60 ℃，60 s；熔解曲線(xiàn)60 ℃→95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃

2.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，血紅鉚釘菇多糖CRPS25-Ⅱ在1～160 μg/ml范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞炎癥因子IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)均有促進(jìn)作用，其中在40 μg/ml時(shí)達(dá)到峰值，80～160 μg/ml呈逐漸減弱的趨勢(shì)，見(jiàn)圖2。

圖2 血紅鉚釘菇多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

2.3 Western-blot法檢測(cè)血紅鉚釘菇多糖對(duì)p-P65蛋白表達(dá)量（β-肌動(dòng)蛋白作內(nèi)參）的影響

2.3.1 細(xì)胞總蛋白提取

收集對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，隨后以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中，加入1 ml的DMEM完全培養(yǎng)基，并于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)24 h。設(shè)置不同濃度梯度的血色鉚釘菇多糖溶液1、20、40、80、160 μg/ml及空白對(duì)照組，于恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h，用PBS沖洗細(xì)胞2～3次，最后一次清洗完成，倒掉PBS，用移液器盡量吸干殘留液體；加入適當(dāng)體積的RIPA裂解液（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培養(yǎng)板/培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)3～5 min。期間反復(fù)晃動(dòng)培養(yǎng)板/瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸；用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中；冰上裂解30 min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。12 000 r/min，4 ℃，離心10 min，收集上清，即為總蛋白溶液.

2.3.2 蛋白變性

將蛋白溶液按照4∶1的比例加入5×還原型蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性15 min，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜

清洗玻璃板；制膠與上樣，放入制膠器，插入斜插板將玻璃板固定，檢查底部是否對(duì)齊，避免漏膠；將分離膠灌到適當(dāng)?shù)母叨?，將純水緩慢均勻加入到分離膠上層，直至加滿(mǎn)。大約30 min后待分離膠凝固即可倒去分離膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干；配制5%的濃縮膠，加入四甲基乙二胺后立即混合均勻，灌膠，開(kāi)始電泳；電泳至溴酚藍(lán)里最底部大約1 cm即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)印完的膜放入裝有TBST的孵育槽中，快速涮洗一次，然后加上脫脂牛奶，放置脫色搖床上，室溫下封閉30 min；按照抗體說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行一抗稀釋?zhuān)渲坪煤?，倒掉孵育槽中的封閉液，加入配制好的一抗，4 ℃孵育搖床過(guò)夜；回收一抗，用TBST快速涮洗膜3次，然后加入TBST，放置脫色搖床上快速洗脫，每次5 min，洗3次；將二抗用TBST按照1∶5 000的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)缓蠹尤敕跤壑?，放置搖床上慢搖，室溫下孵育30 min；用TBST快速涮洗膜3次，然后再加入TBST，放置脫色搖床上快速洗脫，每次5 min，洗3次。

2.3.4 化學(xué)發(fā)光

在暗室中將ECL A液和ECL B液兩種試劑在離心管中等體積混合，在曝光匣上貼雙層PE手套或者其他透明薄膜，將聚偏二氟乙烯膜的蛋白面朝上放在曝光匣兩層薄膜之間，加入混合好的ECL溶液充分反應(yīng)，1～2 min后，去盡殘液，蓋上層薄膜開(kāi)始?jí)耗z片。壓完的膠片用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。

2.3.5 圖像分析和數(shù)據(jù)處理

膠片掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，血紅鉚釘菇多糖CRPS25-Ⅱ在1～160 μg/ml范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞p-P65蛋白的表達(dá)有促進(jìn)作用，其中在40 μg/ml時(shí)達(dá)到峰值，80～160 μg/ml呈逐漸減弱的趨勢(shì)，見(jiàn)圖3。

圖3 血紅鉚釘菇多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞p-P65蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

本文對(duì)血紅鉚釘菇多糖進(jìn)行了研究，在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)水提醇沉的方法制備出血紅鉚釘菇多糖，通過(guò)DEAE纖維素-52柱層析精制得到CRPS25-Ⅱ，而后將CRPS25-Ⅱ溶液按1～800 μg/ml濃度分別加入細(xì)胞懸液中，按照6、12、24 h進(jìn)行培養(yǎng)，考察多糖濃度和孵育時(shí)間對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的影響，最終發(fā)現(xiàn)1～400 μg/ml濃度范圍孵育12 h細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，適于實(shí)驗(yàn)研究。

人體的免疫系統(tǒng)調(diào)控著機(jī)體健康的平衡與穩(wěn)定，巨噬細(xì)胞是人體天然免疫防線(xiàn)的重要一員，參與機(jī)體的非特異性防衛(wèi)（先天性免疫）和特異性防衛(wèi)（細(xì)胞免疫）。巨噬細(xì)胞可以呈遞抗原、分泌細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)，從而調(diào)控機(jī)體微環(huán)境，達(dá)到抗炎、抗腫瘤的作用，細(xì)胞因子通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、生長(zhǎng)和凋亡控制整個(gè)機(jī)體的動(dòng)態(tài)平衡。

本實(shí)驗(yàn)是以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究CRPS25-Ⅱ體外的免疫調(diào)節(jié)活性，探討CRPS25-Ⅱ在體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的作用機(jī)制。通過(guò)MTT法檢測(cè)了CRPS25-Ⅱ?qū)奘杉?xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性，數(shù)據(jù)表明多糖濃度在25～400 μg/ml范圍內(nèi)CRPS25-Ⅱ不具有細(xì)胞毒性，說(shuō)明該藥物應(yīng)用于臨床的安全性較高，具備深入研究的意義。通過(guò)RT-PCR法證實(shí)CRPS25-Ⅱ可顯著促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞釋放IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子，通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞因子的活性，達(dá)到抗炎、抗腫瘤的目的。研究表明多糖濃度在1～160 μg/ml的范圍內(nèi)，CRPS25-Ⅱ?qū)L-6和TNF-α釋放具有顯著促進(jìn)作用，其中1～40 μg/ml濃度范圍呈上升趨勢(shì)，40～160 μg/ml范圍內(nèi)隨著CRPS25-Ⅱ的濃度的增加對(duì)IL-6和TNF-α釋放的促進(jìn)作用逐漸減弱。Western blot試驗(yàn)顯示，CRPS25-Ⅱ作用于RAW264.7細(xì)胞12 h后，1～160 μg/ml濃度范圍內(nèi)血紅鉚釘菇多糖均可顯著誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中p-P65蛋白的表達(dá)，從而激活NF-κB信號(hào)通路，達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的作用。其中1～40 μg/ml濃度范圍對(duì)p-P65蛋白分泌的促進(jìn)作 用 呈 上 升 趨 勢(shì)，40～160 μg/ml范 圍 內(nèi) 隨 著CRPS25-Ⅱ的濃度的增加p-P65蛋白的促進(jìn)作用逐漸減弱。

綜上所述，血紅鉚釘菇多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性，作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑，具有較為廣闊的開(kāi)發(fā)前景，后續(xù)工作可進(jìn)行更加系統(tǒng)深入的研究。