胡彪，崔洲平，魏金亮，張健，王婭，張偉杰，孫志惠，常亞青

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023）

光棘球海膽Mseocentrotus nudus（又稱大連紫海膽）唯一可食用的性腺味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、市場(chǎng)價(jià)值高，是我國(guó)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)海膽之一[1]。

類固醇激素（Steroid hormone）（甾體激素）在維持生命、調(diào)節(jié)性功能以及繁殖調(diào)控等方面行使重要功能，其中性激素，尤其是雌二醇和睪酮在動(dòng)物的性別分化及性腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用。用外源17β-雌二醇處理，可促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟[2]，用外源性17α-甲基睪酮處理能夠促進(jìn)生長(zhǎng)前期的卵泡發(fā)育，后期則呈抑制作用[3]；用外源17α-甲基睪酮處理會(huì)導(dǎo)致斑馬魚Danio rerio 雌魚發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，其性腺表型由卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)榫瞇4]。用外源性17β-雌二醇處理會(huì)導(dǎo)致斑馬魚種群的雌性比例上升，雄魚第二性征減弱，部分雄魚發(fā)育出卵巢樣的性腺[5]；同樣，外源性17β-雌二醇也能促進(jìn)青鳉Oryzias latipes 朝雌性發(fā)育[6]。在外源性17α-甲基睪酮處理下正常雌性虹鱒Oncorhynchus mykiss可被誘導(dǎo)為性腺組織與卵巢類似的偽雄性[7]。無脊椎動(dòng)物中，是否存在與脊椎動(dòng)物類似的性激素尚有爭(zhēng)議[8-10]。用外源雌二醇浸泡處理可促進(jìn)貽貝Elliptio complanata 卵黃蛋白原基因表達(dá)[11]。紅海盤車Asterias rubens 性腺中檢測(cè)到雌二醇和孕酮，且其激素水平與卵巢發(fā)育息息相關(guān)[12]；在同屬海膽綱的巨紫球海膽Strongylocentrotus franciscanus 中，Botticelli 等[13]利用蒸餾、層析等方法，證實(shí)巨紫球海膽性腺中存在雌激素，且17-β 雌二醇活性最強(qiáng)。然而，作為我國(guó)市場(chǎng)價(jià)值較高的光棘球海膽性腺中是否存在性激素尚不明確；性激素在該海膽性腺發(fā)育中的作用也有待探究。

性腺的發(fā)育需要眾多性別相關(guān)基因相互作用、共同調(diào)控。其中dmrt1 基因是目前已知最為保守的、與雄性性別決定和精巢發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因[14]。foxl2 基因則是進(jìn)化上高度保守，與卵巢分化和維持相關(guān)的基因[15,16]。boule 基因隸屬于DAZ 基因家族，是多個(gè)物種生殖細(xì)胞的標(biāo)記基因[17,18]。研究表明，用外源性雌二醇與睪酮處理對(duì)不同物種的dmrt1 和foxl2 基因表達(dá)的影響不同，如雌二醇處理會(huì)降低中華鱉Pelodiscus sinensis 成體dmrt1 基因表達(dá)[19,20]，而使成體與早期胚胎的foxl2 基因表達(dá)上調(diào)；用外源雌二醇處理會(huì)導(dǎo)致斑馬魚dmrt1 基因表達(dá)量顯著上升[21]，導(dǎo)致大黃魚Larimichthys crocea foxl2 基因表達(dá)下調(diào)[22]。用外源睪酮處理后，半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis 會(huì)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，其性別表型由雌性逆轉(zhuǎn)為雄性，由卵巢轉(zhuǎn)化成的精巢中可以檢測(cè)到dmrt1 基因的表達(dá)[23]；外源睪酮處理后，中華鱉雌雄個(gè)體中foxl2 基因表達(dá)上升[20]。而針對(duì)外源性激素對(duì)boule 基因表達(dá)影響的研究較少，雌二醇與睪酮對(duì)boule 基因表達(dá)的影響尚不明確。

在前期研究中，克隆獲得了光棘球海膽dmrt1、foxl2 和boule 基因，發(fā)現(xiàn)dmrt1 基因在光棘球海膽性腺中呈現(xiàn)雄性特異性表達(dá)，foxl2 和boule 基因在光棘球海膽性腺中均呈現(xiàn)差異性表達(dá)，在精巢中表達(dá)量分別為卵巢中的6 倍和25 倍。本研究通過檢測(cè)光棘球海膽性腺中雌二醇、睪酮和孕酮的含量，通過向海膽體內(nèi)注射17β-雌二醇或17α-甲基睪酮，分析海膽性腺中dmrt1、foxl2 和boule 基因的表達(dá)變化，可為進(jìn)一步研究激素對(duì)光棘球海膽性腺發(fā)育的影響提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用光棘球海膽由大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行繁育。隨機(jī)選取60 只，初始直徑（3.47±2.27）cm，初始質(zhì)量（25.04±1.75）g，養(yǎng)殖于循環(huán)水槽中，每天半量換水，每3 d 換水1 次，投喂海帶及常見藻類。

試驗(yàn)藥品為17β-雌二醇（sigma，E8875-250）和甲基睪酮（sigma，M7252-1）溶解于1 mL 無水乙醇，制成10 mg/mL 的母液，然后用葵花籽油稀釋成1 mg/mL 的應(yīng)用液。

1.2 方法

取6 只海膽解剖收集體腔液，于4℃1 000 r/min 離心20 min，分離體腔液上清，保存于超低溫冰箱（-80℃），用于檢測(cè)激素含量。收集海膽的部分性腺組織于無酶離心管中，用液氮速凍后保存于超低溫冰箱（-80℃）中，用于檢測(cè)激素含量。剩余的性腺組織于4%Perfluoroalkoxy（PFA）中，4℃固定過夜；第2 d 用PBS 搖洗三次，每次5 min，完成后用30%蔗糖于4℃滲透過夜；第3 d 用組織包埋劑OCT（Tissue-Tek，上海）包埋，保存于超低溫冰箱（-80℃）中用于制作冰凍切片樣品。

將60 只海膽隨機(jī)分為三組,飼養(yǎng)在用網(wǎng)分隔成三個(gè)區(qū)域的室內(nèi)1 000 L 水槽中：每天用25 μL 微量注射器由圍口膜處注射10 μL 雌二醇應(yīng)用液（雌二醇組）、睪酮應(yīng)用液（睪酮組）和葵花籽油（對(duì)照組）。

持續(xù)注射14 d 后，測(cè)量每組存活海膽的重量和殼徑，解剖、收集海膽的體腔液，于4℃1 000 r/min離心20 min，分離體腔液上清，保存與超低溫冰箱（-80℃），用于檢測(cè)激素含量。收集海膽的消化道和部分性腺于無酶離心管中，液氮速凍后保存于超低溫冰箱（-80℃）中，用于檢測(cè)激素含量及基因表達(dá)。部分性腺于PFA 中4℃固定過夜用于制作冰凍切片樣品。

1.2.1 性腺組織切片觀察

樣品處理：將包埋后的光棘球海膽性腺樣品用冰凍切片機(jī)（LeicaCM1900-1-1）進(jìn)行冷凍切片；將玻片于37℃烘箱中烘烤1 h。

樣品固定：將烘干的載玻片置于裝滿PBS 的臥式染缸中，室溫?fù)u洗2 次，每次5 min；用4%PFA 固定樣品；隨后用PBS，室溫?fù)u洗2 次，每次5 min，洗去多余的PFA。

染色：將固定后的載玻片用蒸餾水沖洗2～3 min；蘇木精染色15 s；自來水沖洗，洗去浮色；1%鹽酸酒精（1 mL 濃鹽酸加入99 mL70%無水乙醇）分化3～10 s，切片變紅，顏色變淺。

水洗終止分化：自來水搖洗10 min，反藍(lán)；伊紅染色1 min；蒸餾水沖洗；70%乙醇30 s；80%乙醇1 min；90%乙醇2 min；甘油封片。

鏡檢：使用Leica DM4B 鏡檢觀察并拍照。

激素測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測(cè)性腺和體腔液中雌二醇、睪酮和孕酮的含量。按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行測(cè)定操作。使用cpectraMax i3x（MOL ECULAR）酶標(biāo)儀檢測(cè)激素含量。

1.2.2 相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

總RNA 的提取及cDNA 的合成：參照SV Tolal RNA laolation System（Promaga Z3100）說明書提取總RNA，隨后用瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)（BiochromLtd 公司，英國(guó)）檢測(cè)RNA 質(zhì)量。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaRaKa634860）試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

熒光定量PCR 檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)：用Light-Cycler96 Instrumen（tRoche，美國(guó)）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析dmrt1、foxl2、boule 基因的表達(dá)，以Ubiquitin為內(nèi)參基因。熒光定量PCR 所用引物由http://biotools.nubic.northwestern,edu/OligoCalc.html 網(wǎng)站設(shè)計(jì)（表1），所用熒光DNA 聚合酶為SYBR Green I Dye。所用體系如下：FastStart Essential DNA Green Master 10 μL，上下游引物各0.8 μL，無菌水6.4 μL，cDNA 2 μL，共20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min；94℃15 s，60℃60 s，72℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。采用2－△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR 引物序列Tab.1 Sequence of the primers used for real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 光棘球海膽性腺及體腔液中性激素的含量

光棘球海膽性腺發(fā)育主要分為恢復(fù)期、生長(zhǎng)期、成熟前期和成熟期四個(gè)時(shí)期[24]。處于不同發(fā)育時(shí)期的性腺內(nèi)各類細(xì)胞分布均有所差異。經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，恢復(fù)期的性腺中，充滿了染色較淺的營(yíng)養(yǎng)吞噬細(xì)胞，而染色較深、分布稀少的則為卵原細(xì)胞和精原細(xì)胞；生長(zhǎng)期的性腺中，營(yíng)養(yǎng)吞噬細(xì)胞位于生殖腺中部，卵原細(xì)胞和精原細(xì)胞則排列于生殖腺濾泡壁；在成熟前期性腺中，仍然可見營(yíng)養(yǎng)吞噬細(xì)胞；成熟的卵母細(xì)胞和精母細(xì)胞開始向生殖腺中央轉(zhuǎn)移；在成熟期的性腺中，營(yíng)養(yǎng)吞噬細(xì)胞變少，成熟的卵子和精子占據(jù)了絕大空間。通過蘇木精-伊紅染色和鏡檢，對(duì)光棘球海膽性腺發(fā)育情況進(jìn)行了發(fā)育分期判定，檢測(cè)了成熟期的雄性（圖1-A 和圖1-B）和雌性（圖1-C 和圖1-D）個(gè)體體腔液和性腺中的睪酮、雌二醇以及孕酮的含量。

圖1 光棘球海膽性腺組織學(xué)檢測(cè)Fig.1 Histological observation of the gonads of sea urchin Mseocentrotus nudus

結(jié)果表明，在光棘球海膽的性腺中，睪酮含量存在極顯著的性別差異。精巢中睪酮的含量是卵巢中的2.99 倍（表2）。但是，雌二醇和孕酮在卵巢中的含量顯著高于精巢中，其中卵巢中雌二醇的含量是精巢中雌二醇含量的1.87 倍，孕酮的含量是精巢的2.35 倍（表2）。在光棘球海膽的體腔液中沒有檢測(cè)到以上三種激素的存在。

表2 光棘球海膽性腺中雌二醇、睪酮和孕酮的激素的含量Tab.2 Contents of estradiol（E2）,testosterone（MT）and progesterone（PROG）in the gonad of sea urchin Mseocentrotus nudus

2.2 雌二醇處理對(duì)光棘球海膽性腺中性別相關(guān)基因表達(dá)的影響

考慮到睪酮和雌二醇在光棘球海膽性腺中的表達(dá)差異顯著，采用注射外源激素的方式探討了性激素在光棘球海膽性腺發(fā)育中的功能。持續(xù)注射雌二醇14 d 后，熒光定量PCR 檢測(cè)表明，光棘球海膽精巢中dmrt1 基因的表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低70.8%；foxl2 基因的表達(dá)量與對(duì)照組無顯著差異（圖2-A）。dmrt1 基因在對(duì)照組與雌二醇處理組卵巢中均不表達(dá)；雌二醇處理后，foxl2 和boule 基因的表達(dá)量較對(duì)照組顯著上調(diào)，分別升高了2.25 倍和6.41倍（圖2-B）。

圖2 雌二醇處理對(duì)光棘球海膽性腺中性別相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of estradiol injection on sex-related gene expression level in the gonads of sea urchin

2.3 睪酮處理對(duì)光棘球海膽性腺中性別相關(guān)基因表達(dá)影響

持續(xù)注射14 d 睪酮后，光棘球海膽卵巢中dmrt1 基因在對(duì)照組與雌二醇處理組中均不表達(dá)，foxl2 基因的表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高約2.66 倍，boule 基因較對(duì)照組顯著上調(diào)約3.10 倍（圖3-A）；光棘球海膽精巢中dmrt1 和boule 基因的表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低了72.6%和71.0%（圖3-B），foxl2基因的表達(dá)量與對(duì)照組無顯著差異。

圖3 睪酮處理對(duì)光棘球海膽性腺中性別相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of testosterone injection on sex-related gene expression level in the gonads of sea urchin

3 討論

本研究利用ELSA 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在光棘球海膽精巢和卵巢中均檢測(cè)到雌二醇、睪酮和孕酮三種性激素，且存在明顯的性別差異。精巢中睪酮的含量較高，而卵巢中雌二醇和孕酮的含量較高。雌二醇是生物活性最強(qiáng)的雌激素，在維持雌性第二性征中發(fā)揮重要作用[25]。哺乳動(dòng)物黃體產(chǎn)生的孕酮可以與雌激素共同維持雌性生殖系統(tǒng)的正常功能。睪酮對(duì)促進(jìn)性器官發(fā)育、精子發(fā)生和早期卵泡發(fā)育，以及維持第二性征等具有重要意義[26]。濃度為50 ng·L-1以上的甲基睪酮可以有效地提高稀有鯽Gobiocypris rarus 的性腺指數(shù)，促進(jìn)性腺發(fā)育[27]。外源性甲基睪酮可以誘導(dǎo)鯔Mugil cephalus L.雄性精子發(fā)生與精子形成[28]。海膽Paracentrotus lividus 和海星Asterias vulgaris 配子發(fā)育也與性激素水平息息相關(guān)[29,30]。性激素可能在光棘球海膽性別分化與性腺發(fā)育過程中也發(fā)揮類似的重要的調(diào)控作用。

外源性激素處理影響物種的性別分化、性腺發(fā)育、性別表型等及性別發(fā)育信號(hào)調(diào)控通路中的基因表達(dá)。在本研究中，雌二醇和睪酮處理均能顯著降低光棘球海膽dmrt1 基因表達(dá)，這與中華鱉及半滑舌鰨中的研究結(jié)果一致[19-23]。無論使用雌二醇處理，還是用睪酮處理，均能提高雌性海膽性腺中foxl2基因的表達(dá)。高麗麗等發(fā)現(xiàn)，雌二醇和睪酮均能促進(jìn)中華鱉foxl2 基因的表達(dá)[20]。這可能是外源性睪酮在海膽體內(nèi)可能轉(zhuǎn)化為了雌二醇，使與精巢發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)量下調(diào)，而與卵巢發(fā)育和維持相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)。雌二醇和睪酮處理均能夠使雌性海膽卵巢中boule 基因的表達(dá)量升高。boule 基因作為生殖細(xì)胞標(biāo)記基因，其上調(diào)表達(dá)意味著生殖細(xì)胞數(shù)目或者體積增加。在中間球海膽中，注射雌二醇可顯著提高海膽的性腺指數(shù)[31]。推測(cè)使用雌二醇和睪酮處理可能會(huì)促進(jìn)雌性光棘球海膽的性腺發(fā)育。本研究為解析性激素的進(jìn)化奠定基礎(chǔ)，可為更好地了解雌二醇與睪酮對(duì)光棘球海膽性別控制方向的影響，為未來單性養(yǎng)殖棘皮動(dòng)物提供參考。