黃 峰 徐國超 金辰怡

種植牙是口腔臨床比較常見的修復牙列缺損的方法，其成功有賴于良好的骨結(jié)合。目前，有很多的學者致力于骨結(jié)合的研究，如對植體表面改性，或應用生長因子等。然而，更合適的鈦表面處理同時加載生長因子仍需進一步探索。納米管表面能夠顯著增加成骨細胞的黏附力并與骨之間具有較強的結(jié)合力，且能夠作為一些生長因子、藥物以及抗菌劑的緩釋載體而發(fā)揮它們的功能[1～5]。近些年的研究認為NGF與骨和關(guān)節(jié)愈合相關(guān)[6～11]。但加載方法大多采用注射法、滲透泵或者外部載體加載法，操作上較為繁瑣且存在感染風險。那么如何應用合適的植體表面改性來加載NGF，保持其活性和作用非常重要。

本研究通過采用種植體表面制備的納米管加載NGF，建立比格犬的下頜種植模型，觀察載NGF納米管對種植體界面骨愈合的影響。

材料與方法

1.實驗動物：選取由浙大實驗動物中心提供的6只比格犬。雄性，8月齡，體質(zhì)量10～13kg。其飼養(yǎng)及手術(shù)均遵循浙江大學《實驗動物倫理管理條例》。

2.制備納米管結(jié)構(gòu)，加載NGF并觀察其釋放情況：選擇實驗用純鈦種植體(浙江大學附屬口腔醫(yī)學院種植科提供)。植體消毒后，表面用400～2000目的砂紙進行拋光，并于超聲震蕩清洗，然后浸入0.5%氫氟酸溶液，進行陽極氧化。電壓作用2h制備納米管結(jié)構(gòu)(R=30nm)。去離子水清洗，浸入鼠重組NGF溶液(濃度10mg/L，由北京舒泰神有限公司提供，國藥準字S2060023，批號:20080101)。浸沒時間設(shè)定24h，重復直到合適劑量的NGF均勻涂于表面。隨后浸入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中。每天取浸提液-70℃進行保存。加入等量磷酸鹽緩沖液，分析NGF釋放情況。

3.比格犬種植模型的建立與分組：比格犬于局部浸潤麻醉下拔除雙側(cè)下頜第一、二前磨牙，同期植入種植體。于每顆前磨牙的遠中拔牙窩植入種植體，在其近中制作3mm×3mm×3mm的缺損，雙側(cè)各植入2顆。于每只比格犬的左側(cè)下頜骨植入2顆載NGF納米管種植體作為實驗組(共12例)。右側(cè)下頜骨各植入1顆納米管種植體和1顆未處理實驗用種植體，分別作為對照組和空白組(各6例)。術(shù)后予抗生素應用3天。分別于植入4周和8周取樣。

4.大體觀察：種植術(shù)后每周觀察種植體情況和比格犬狀況。

6.組織學觀察：種植體植入4周和8周取樣，用現(xiàn)配的4%甲醛溶液固定，梯度脫水后浸入甲基丙烯酸甲酯單體，包埋、切片、磨片。行亞甲基藍-酸性品紅法染色。

8.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.基本情況：實驗的比格犬全部存活，術(shù)后創(chuàng)面愈合良好，未見紅腫溢膿等。所有種植體均未脫落且穩(wěn)定性良好。

2.ALP測定：術(shù)后4周實驗組ALP活性略低，但差異無統(tǒng)計學意義。隨著術(shù)后時間延長，ALP均降低。各組的ALP值降幅相近。術(shù)后8周，3組ALP活性均低于術(shù)后4周，成骨細胞的成骨能力趨于減弱，新骨已經(jīng)開始礦化(表1)。

表1 術(shù)后4周和8周各組ALP活性檢測(U×10-2/g濕重，

3.組織學觀察：術(shù)后4周種植體表面可見散在分布的新生纖維組織，其間可見骨小梁結(jié)構(gòu)。骨小梁聯(lián)結(jié)成型，界面以骨性連接為主，新生骨以骨組織面向種植體表面進行生長。新生骨小梁(紅粉色)表面存在許多類骨質(zhì)(亮藍色)。術(shù)后8周可見種植體界面大面積由新生骨質(zhì)覆蓋，新生骨出現(xiàn)明顯礦化，其程度高于種植體植入4周時的表現(xiàn)。3組種植體界面的新骨均出現(xiàn)礦化，其中以實驗組較明顯，后兩組新生骨略少且礦化也略低(圖1)。

圖1 各組種植-骨界面組織學觀察亞甲基藍-酸性品紅,×40

4.種植體骨結(jié)合率：術(shù)后4周，種植體骨結(jié)合率實驗組顯著高于另兩組(P<0.05)。術(shù)后8周，實驗組略高于另兩組(P>0.05，表2)。

表2 術(shù)后4周和8周各組種植體骨結(jié)合率

討 論

即刻種植是指拔牙同期進行種植。目前它在口腔臨床中已廣泛應用。對于牙列缺損或牙列缺失的患者來說，即刻種植能夠立即改善美觀，幫助恢復發(fā)音和咀嚼功能，同時恢復面部形貌，是目前最佳的治療方案。如何促進即刻種植的早期骨結(jié)合是研究者的關(guān)注點。研究發(fā)現(xiàn)種植體表面形貌的改變能夠獲得更好的早期骨結(jié)合，種植體表面的納米管結(jié)構(gòu)能夠促進成骨細胞的成熟，從而促進骨結(jié)合[14～16]。此外，納米管結(jié)構(gòu)還能作為一些生物因子、藥物和抗菌劑的緩釋載體[1,5]。

NGF能夠刺激成骨相關(guān)細胞的成骨能力[17]。有研究者應用NGF后發(fā)現(xiàn)ALP含量升高，成骨細胞數(shù)量增加，成骨活性增強[18]。本研究中，隨著植入時間延長，植體界面的骨發(fā)生變化，ALP出現(xiàn)下降。說明在新骨沉積時，成骨細胞能力減弱。其中實驗組ALP活性較對照組和空白組偏低，說明NGF促進了新生骨的礦化和成熟，縮短了骨愈合所需的時間。

NGF能夠促進骨生長。近年來研究表明，NGF可通過改變成骨相關(guān)細胞的能力，促進成骨增強從而促進骨組織的愈合和種植體的骨結(jié)合[19～21]。骨結(jié)合中，新生血管非常關(guān)鍵。已有的研究認為NGF能促進新生血管形成，從而促進種植體的骨結(jié)合[22，23]。本研究組前期通過研究比格犬種植，也發(fā)現(xiàn)NGF能夠促進早期骨結(jié)合。通過建立兔的種植模型，發(fā)現(xiàn)注射NGF能促進種植體四周新骨生成。日本研究者也通過研究發(fā)現(xiàn)，通過滲透泵載NGF的種植體不但能夠促進下牙槽神經(jīng)的功能再生，同時能夠促進種植體的骨結(jié)合[24]。但不管是利用明膠海綿加載法、局部注射亦或是滲透泵法，操作上容易出現(xiàn)感染或者比較煩復。因而本實驗中筆者利用種植體表面制備的納米管加載NGF，觀察種植體界面的骨質(zhì)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后4周，界面以新生骨連接，其中種植體與新骨的接觸面積以實驗組稍高。術(shù)后8周，各組新生骨出現(xiàn)礦化，其中實驗組較明顯。表明NGF能夠促進種植體界面骨愈合，納米管能夠作為NGF很好的載體發(fā)揮其功能。

綜上所述，載NGF納米管結(jié)構(gòu)能夠促進種植體界面的早期骨愈合，促進新骨沉積礦化，縮短骨愈合時間，有利于種植體骨結(jié)合。