李 勁，王俊翔，羅周嵩，鄭馥荔，吳思英，李煌元

環(huán)境因素如重金屬等的暴露能夠引起氧化應激，導致神經(jīng)系統(tǒng)損害，加劇神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，鈷納米顆粒(cobalt nanoparticles, Co-NPs)可能通過多種途徑暴露，誘導細胞發(fā)生氧化應激，促進細胞凋亡，對人體產生神經(jīng)損害[3-8]。本研究擬采用大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12作為體外模型，通過檢測Co-NPs染毒后的神經(jīng)損害作用、氧化應激指標變化、核因子類紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2, NRF2)/血紅素加氧酶(heme oxygenase-1, HO-1)抗氧化信號通路的激活及NRF2特異性激活劑(tert-butylhydroquinone,tBHQ)預處理，探討Co-NPs對神經(jīng)細胞的毒效應及氧化應激作用，為評估Co-NPs的神經(jīng)毒性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 Co-NPs(中國阿拉丁生化科技股份有限公司)，處理與表征方法及結果見文獻[9]。Co-NPs平均粒徑為96 nm。zeta電位14.9 mV，多分散指數(shù)為0.471。Co-NPs在水溶液中鈷離子12 h 的釋放率為1.52‰，24 h為1.75‰。DMEM高糖細胞培養(yǎng)基、胎牛血清及抗生素(美國Gibco公司)；Hoechst33258染料(中國碧云天生物技術有限公司)；CCK8試劑盒(中國白鯊生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)；Annexin V/7-AAD(美國BD公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、NRF2、HO-1抗體(美國Abcam公司)；tBHQ(美國MCE公司)。

1.1.2 儀器 倒置顯微鏡(CK40-F200 BH-2型，日本OLYMPUS公司)；生物成像系統(tǒng)(Tanon 4100型，上海天能公司)；垂直電泳槽、電泳儀、轉印槽(美國Bio-Rad公司)；酶標儀(Spectra Max 190型，美國Molecular Devices公司)；流式細胞儀[FACSCanto(TM)Ⅱ型，美國BD公司]。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) PC12細胞來自大鼠的嗜鉻細胞瘤(中國科學院上海細胞庫)，置于含10%胎牛血清、雙抗(青霉素100 U/mL,鏈霉素100 mg/L)的DMEM高糖細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃，體積分數(shù)為0.05的 CO2培養(yǎng)箱)，生長至對數(shù)生長期時種板。

1.2.2 Hoechst 33258染色 細胞鋪于6孔板中。100、200 μmol/L Co-NPs處理24 h后，加入Hoechst3325染色液染色，使用熒光倒置顯微鏡觀察細胞凋亡。每孔選擇5個視野統(tǒng)計凋亡數(shù)目。

1.2.3 Annexin V/7-AAD染色 細胞鋪于6孔板中。100、200 μmol/L Co-NPs處理 24 h 后，加入Annexin V/7-AAD染色液染色，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 MDA、GSH及GSH-Px含量檢測 細胞鋪于60 mm培養(yǎng)皿。100、200 μmol/L Co-NPs處理24 h后收集細胞，按照操作說明檢測MDA、GSH及GSH-Px含量。

1.2.5 蛋白印跡法(Western-blot) 細胞接種于6孔板中。100、200 μmol/L Co-NPs 處理24 h后，將細胞刮下并移至1.5 mL離心管中，12 000×g離心10 min，收集上清液。取一部分蛋白進行BCA蛋白定量，其余加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min 后置于-20 ℃?zhèn)溆?。?0～30 μg蛋白，100 V 電壓下10%聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白分離。將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，以奶粉稀釋后的GAPDH、NRF2、HO-1(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜。使用1×TBST清洗孵育過的條帶后，二抗孵育1.5 h，使用1×TBST清洗，并用ECL顯影液顯影并曝光。曝光后的條帶采用Image J軟件進行分析。

1.2.6 CCK8實驗 細胞鋪于96孔板中。40 μmol/LtBHQ不處理或預處理24 h后加入100、200和400 μmol/L Co-NPs處理24、48 h。將培養(yǎng)基換成含10%CCK8反應液的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃反應30 min，置于酶標儀上檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0軟件進行分析。多組間比較采用one-way ANOVA進行顯著性檢驗，多組間兩兩比較采用LSD法進行顯著性檢驗。P<0.05為差別具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Co-NPs誘導PC12細胞凋亡 Co-NPs處理PC12細胞24 h后，Hoechst33258染色顯示，100、200 μmol/L 劑量組細胞凋亡水平分別升高14和24倍(P<0.05，圖1A)。Annexin V/7-AAD染色顯示，100、200 μmol/L劑量組細胞凋亡水平分別升高15和19倍(P<0.05，圖1B)。

n=3。Co-NPs：鈷納米顆粒。A：使用Hoechst33258染料進行染色觀察細胞凋亡水平(×100)；B：使用Annexin V/7-AAD染料進行染色觀察細胞凋亡水平。與對照組比較，#：P<0.05。

2.2 Co-NPs誘導PC12細胞發(fā)生氧化應激 Co-NPs 處理PC12細胞24 h后，200 μmol/L劑量組的細胞內MDA水平升高4倍(P<0.05)。100、200 μmol/L劑量組GSH蛋白含量分別降低14和9 μmol/g(P<0.05)。100、200 μmol/L劑量組GSH-Px分別升高1.5和2.5倍(P<0.05，圖2)。

n=3。Co-NPs：鈷納米顆粒；MDA：丙二醛；GSH：谷胱甘肽；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶。A：Co-NPs處理后MDA含量變化；B：Co-NPs處理后GSH含量變化；C：Co-NPs處理后GSH-Px含量變化。與對照組比較，#：P<0.05。

2.3 PC12細胞NRF2和HO-1蛋白表達水平升高 Co-NPs處理PC12細胞24 h后，100、200 μmol/L劑量組NRF2蛋白表達水平分別升高2.7和2.9倍(P<0.05)；200 μmol/L劑量組的HO-1蛋白表達水平升高1倍(P<0.05，圖3)。

n=3。Co-NPs：鈷納米顆粒。NRF2：核因子類紅細胞2相關因子2；HO-1：血紅素加氧酶。A：NRF2蛋白表達水平；B：HO-1蛋白表達水平。與對照組比較，#：P<0.05。

2.4tBHQ恢復Co-NPs引起的PC12細胞活力下降 100、200和400 μmol/L Co-NPs處理PC12細胞24 h后，細胞活力分別下降了18%、37%和64%(P<0.05)；100、200和400 μmol/L Co-NPs處理PC12細胞48 h后，細胞活力下降了66%、75%和85%(P<0.05)。預處理tBHQ后，細胞活力得到恢復(P<0.05)(圖4)。

Co-NPs：鈷納米顆粒；tBHQ：特丁基對苯二酚。與對照組比較，#：P<0.05；與Co-NPs處理組比較，△：P<0.05。

3 討 論

鈷及其納米顆粒性質穩(wěn)定，耐高溫和腐蝕，同時還具有高磁性，因而廣泛應用于人工合金假體、新能源電池、航空航天以及油漆顏料等多個方面。研究發(fā)現(xiàn)，人腦中可以檢測出環(huán)境中暴露的鈷相關納米顆粒[5]，提示鈷及其納米顆?？赡芡ㄟ^職業(yè)暴露[10]、環(huán)境暴露[11]、醫(yī)源性暴露[4]等途徑作用于人體，從而發(fā)揮其毒性效應。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，Co-NPs可致大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損害效應[9]。為進一步闡明Co-NPs的神經(jīng)毒性及可能的機制，本研究利用PC12細胞建立Co-NPs暴露的體外模型。PC12細胞源自大鼠的嗜鉻細胞瘤，具有神經(jīng)內分泌細胞的一般特征，同時具有可傳代的特點，高度分化的PC12細胞具有神經(jīng)元的特性，因此，廣泛應用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學研究[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Co-NPs處理后，PC12細胞發(fā)生細胞凋亡，且氧化應激指標改變[13]，表現(xiàn)為GSH-Px生成增多，催化GSH變?yōu)镚SSH，使前者含量減少；另一方面，Co-NPs也激活了NRF2/HO-1通路，NRF2的表達升高，促進其靶基因HO-1蛋白表達。

鈷可引起氧化應激，并激活NRF2相關通路[2]。NRF2發(fā)揮著細胞抗氧化的功能，與細胞氧化應激和凋亡密切相關[14]，能夠調控一系列抗氧化劑響應元件依賴性基因的基礎表達和誘導表達，包括抗氧化劑蛋白和Ⅱ期解毒酶，如HO-1[15]。NRF2調控靶基因參與保護細胞免受氧化劑和炎癥性物質的破壞，維持線粒體功能、細胞氧化還原和蛋白質穩(wěn)態(tài)[16]，而NRF2/HO-1作為經(jīng)典的氧化應激通路[2]，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[17]。本研究結果表明，Co-NPs處理后，PC12細胞中MDA、GSH-Px含量升高，而GSH含量降低，說明氧化應激在Co-NPs致PC12細胞損害中發(fā)揮作用。此外，Co-NPs處理能夠引起PC12細胞NRF2及HO-1蛋白表達增多。NRF2的激活會導致抗氧化劑HO-1的表達增加，其與神經(jīng)元細胞損傷修復密切相關[18]。采用抗氧化劑暨NRF2激活劑tBHQ處理，發(fā)現(xiàn)tBHQ能夠緩解Co-NPs引起的細胞毒性，使細胞活性部分回升。上述結果說明，Co-NPs處理PC12細胞后，由于應激，細胞內源性的NRF2/HO-1抗氧化通路被激活，但仍然不足以逆轉Co-NPs導致的PC12細胞損傷，導致PC12細胞凋亡。在此基礎上，加入tBHQ進一步激活NRF2，可緩解由Co-NPs 引起的PC12細胞活力下降，在Co-NPs處理48 h組中，細胞活力回升更加明顯，說明NRF2/HO-1通路的激活可幫助PC12細胞抵御Co-NPs所致的神經(jīng)損害。

綜上所述，Co-NPs能誘導PC12細胞發(fā)生凋亡和氧化應激，同時應激性激活NRF2/HO-1信號通路，而NRF2的激活可幫助細胞抵御Co-NPs所致的神經(jīng)毒性，為Co-NPs暴露引起神經(jīng)損害的機制研究提供依據(jù)。