陳 玲，劉 英，朱艷陽，胡 莉，張秋玉，2

胃癌是我國惡性腫瘤中危害最為嚴重的疾病之一。2020年，中國胃癌新發(fā)病例數(shù)48萬，死亡病例數(shù)37萬，發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)的44%和48%[1]。傳統(tǒng)的治療胃癌的方案包括放化療、手術(shù)及靶向治療等。目前，已有多項免疫治療研究在胃癌治療中開展[2-3]。2020年3月，程序性死亡受體(programed death-1, PD-1)阻斷劑納武利尤單抗在中國獲批用于治療晚期胃癌，標志著免疫治療在胃癌中取得重要進展。臨床Ⅲ期試驗顯示：PD-1抗體使得患者1 a生存率提高至27.3%，是對照組的2倍[4]。如何進一步提高PD-1抗體等免疫治療方案的受益患者比例是腫瘤免疫學研究領(lǐng)域的熱點問題。構(gòu)建反映胃癌臨床特征的實驗動物模型，將有助于推進免疫治療方案在胃癌治療中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用，提高胃癌的免疫治療效果。

患者來源的腫瘤組織異種移植(patient derived xenograft, PDX)模型是通過將患者新鮮的腫瘤組織直接移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)而建立的腫瘤模型[5-6]。該模型能更好地模擬人腫瘤組織的生長情況和微環(huán)境，并可在組織病理學、分子生物學和基因水平上保留原代腫瘤的大部分特點。因其具有較好的臨床療效預(yù)測性，被廣泛應(yīng)用于腫瘤基礎(chǔ)研究及腫瘤藥物臨床前藥效評估[7-9]。然而，隨著免疫治療的迅速發(fā)展，如何在動物模型中重建人體免疫微環(huán)境成為亟待解決的問題。通常情況下，腫瘤組織中天然存在浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)，是免疫微環(huán)境的主要組成部分，并在清除腫瘤細胞中發(fā)揮重要作用[10]。在異種移植過程中，這些TIL能否隨腫瘤一起進入小鼠體內(nèi)及在異體中的存活和狀態(tài)如何，相關(guān)研究仍較少。

本研究旨在建立胃癌免疫PDX模型，分析人源TIL在腫瘤組織及小鼠外周血的存活情況，為提高抗腫瘤免疫藥物治療胃癌的療效預(yù)測提供動物模型依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與臨床樣本 NCG(NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt)免疫缺陷小鼠，雌性，SPF級，6～8 周齡，體質(zhì)量20～24 g[江蘇集萃藥康生物科技有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008]，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學實驗動物中心SPF屏障系統(tǒng)，并在實驗動物管理與使用指南下進行實驗(動物倫理審查號為2017-035)。選取2017年1—12月福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的新鮮胃癌組織樣本3 例。術(shù)前均未接受任何治療。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均自愿參加并簽署知情同意書{倫理審查號為[2017]福醫(yī)倫理審字第(27)號(2017vNO.27)}。

1.1.2 試劑 流式細胞術(shù)檢測抗體FITC標記的抗小鼠CD14、PE標記的抗人CD3及PerCPcy5.5標記的抗人CD8(美國Thermo Fisher Scientific公司)；免疫組織化學抗體羊抗人CD3(美國Abcam公司)；免疫組織化學染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌腫瘤組織的移植與傳代 新鮮腫瘤組織在離體2 h內(nèi)接種于NCG小鼠。初次移植的具體步驟如下：將腫瘤塊分成兩份，1份用于組織化學包埋和冰凍樣本保存；另1份平均切成多塊5 mm×5 mm×5 mm的正方小塊。NCG小鼠下背部中間縱向切口1 cm，用無菌棉球棒從切口伸入，由下而上推至上背部，為腫瘤塊的植入疏通皮下空間。將切好的腫瘤塊從切口移至小鼠上背部，兩側(cè)各移植1塊?？p合切口。待小鼠蘇醒后放入籠內(nèi)并持續(xù)監(jiān)測其腫瘤生長情況。再次移植傳代時，CO2窒息法處死荷瘤小鼠，無菌條件下取出皮下腫瘤，并切成3 mm×3 mm×3 mm的小塊。按上述方法接種至新的NCG小鼠皮下，此即第二代移植腫瘤(P1)，移植前保存部分第一代腫瘤組織(P0)。

1.2.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，H-E)及免疫組織化學染色 取移植前(primary)、移植后5周(P0)及二次傳代(P1)后2周的腫瘤組織浸泡于10%福爾馬林溶液中固定24 h；常規(guī)脫水制作石蠟切片。H-E染色觀察組織病理變化。羊抗人CD3抗體作為一抗，通過免疫組織化學染色觀察T細胞在組織中的浸潤情況。

1.2.3 流式細胞術(shù)分析 小鼠眼眶靜脈取血，裂解紅細胞后，制成單細胞懸液。加入抗小鼠CD16/CD32抗體封閉處理15 min，加入FITC標記的抗小鼠CD14、PE標記的抗人CD3和PerCPcy5.5標記的抗人CD8抗體，4 ℃避光染色30 min后上機進行流式細胞術(shù)分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 腫瘤大小以長短徑的平均值表示，并用GraphPad Prism 8.0軟件進行作圖；采用FlowJo軟件分析流式細胞術(shù)檢測結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌免疫PDX模型的建立 將胃癌腫瘤組織分為8 小塊，移植到4 只NCG小鼠(分別命名為P0-1、P0-2、P0-3和P0-4)背部兩側(cè)(L和R)。移植2 周后，4 只小鼠背部皮下均可見腫塊(圖1A)。隨著時間延長，接種的7 個腫塊直徑逐漸增大，且在移植8 周后生長更為迅速，生長特性符合腫瘤增殖的生物學特征;1 個腫塊未見明顯增長，且在移植8 周后開始減小(圖1B)。移植12周后，取生長迅速的腫瘤塊P0-2L傳代至2 只新的NCG小鼠皮下，即第二代(P1)，P1代腫瘤塊的生長速度較P0代更快(圖1C)。

PDX：患者來源的腫瘤組織異種移植。A：新鮮胃癌腫瘤組織及小鼠皮下移植5 周后腫瘤組織照片；B、C：原代移植(P0)及再次移植(P1)腫瘤組織的生長曲線。P0-1、2、3、4及P1-1、2代表不同NCG小鼠編碼，L和R代表左側(cè)和右側(cè)組織。

2.2 免疫PDX病理及組織化學分析 P0代腫瘤移植5周后，取出P0-3和P0-4荷瘤小鼠的腫瘤進行組織H-E及免疫組織化學染色分析。與Primary腫瘤組織比較，初次移植第5周(P0-3L)及再次移植第2周(P1-1L)的腫瘤組織仍保留胃癌細胞的形態(tài)特征，表現(xiàn)為細胞異形，核大小不一，核漿比例高。在移植與傳代過程中，亦可見腫瘤組織發(fā)生形態(tài)變化，包括：(1)腺管樣結(jié)構(gòu)減少，移植前腫瘤組織中可見明顯的、較多的腺管樣結(jié)構(gòu)散布其中，移植后腺管樣結(jié)構(gòu)減少并且變小，再次移植腫瘤中無腺管樣結(jié)構(gòu)；(2)人基質(zhì)細胞減少，小鼠纖維細胞逐漸增多且侵入到腫瘤組織內(nèi)部，逐漸取代人基質(zhì)細胞。免疫組織化學染色顯示，Primary胃癌腫瘤組織中有較多的T淋巴細胞浸潤，P0代T細胞數(shù)量逐漸減少，P1代后腫瘤組織檢測不到T細胞(圖2)。

A：H-E染色結(jié)果；B：CD3免疫組織化學染色結(jié)果。Primary、P0和P1分別為新鮮、首次移植和再次移植后的腫瘤組織，3L及1L為移植小鼠的標號。

2.3 荷瘤小鼠外周血人源性T細胞分析 通過流式細胞術(shù)定期檢測荷瘤小鼠外周血人源性T細胞比例，可見移植2周后，小鼠外周血白細胞中人CD8+CD3+T細胞比例極低(<1%)，隨后開始上升；移植4～5周后，人CD8+CD3+T細胞比例達到峰值(P0-1小鼠為24.5%，P0-2小鼠為16%)，隨后開始下降；移植10周后，人CD8+CD3+T細胞比例仍為4%(圖3)。

PDX：患者來源的腫瘤組織異種移植。A：移植后不同時間點小鼠外周血CD3+CD8+T細胞比例的流式細胞術(shù)分析圖(設(shè)門在小鼠外周血活細胞中)；B：流式細胞術(shù)分析免疫結(jié)果的統(tǒng)計圖(P0-1及P0-2為初次移植的小鼠編號)。

3 討 論

隨著胃癌臨床免疫治療的推廣應(yīng)用，相應(yīng)的人源免疫系統(tǒng)PDX模型的構(gòu)建逐漸成為研究熱點。利用PDX模型重建人源免疫系統(tǒng)，是研究腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用及評估預(yù)測免疫治療藥物抗腫瘤效果的關(guān)鍵。已有文獻報道，移植CD3陽性造血干細胞(hematopoietic stem cell, HSC)的免疫缺陷小鼠體內(nèi)，可以產(chǎn)生包括人T、B細胞在內(nèi)的多種免疫細胞[11-13]。但由于MHC的限制性，產(chǎn)生的人T細胞無法與小鼠抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)相互作用，導致腫瘤移植后不能產(chǎn)生有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[14-15]。盡管自體同源的骨髓、胎肝和胸腺組織共移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，可以克服上述問題，但這些組織較難獲得，模型建立過程復(fù)雜且耗時較長，其廣泛應(yīng)用具有一定的局限性[16-17]。相較于人造免疫系統(tǒng)，隨腫瘤組織一起移植的TIL更能充分反映原代腫瘤的免疫微環(huán)境。本研究從胃癌手術(shù)中獲取新鮮腫瘤組織構(gòu)建PDX模型。鑒于已有的研究報道TIL主要集中于腫瘤周邊組織[7]，本研究取材時選擇靠近正常組織邊緣的腫瘤組織。免疫組織化學結(jié)果顯示，移植5周后仍能在腫瘤組織中檢測CD8 T細胞的浸潤，但再次移植2周后腫瘤組織無法檢測到CD8 T細胞。這些結(jié)果為探索潛在的腫瘤免疫藥物提供了實驗?zāi)Ｐ汀１狙芯拷Y(jié)果提示，移植后5周的人胃癌免疫模型仍可用于研究腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用，不建議使用多次傳代的移植模型。

本研究分析了胃癌PDX模型小鼠外周血的人源T細胞比例變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在移植后2周即可在小鼠外周血測到腫瘤組織來源的CD3+CD8+T細胞，隨后比例逐漸上升，提示PDX模型小鼠體內(nèi)存在人源T細胞擴增現(xiàn)象。Simpson-Abelson等[18]報道，人源CD8T細胞在人肺癌PDX模型小鼠體內(nèi)有擴增現(xiàn)象。根據(jù)已有的文獻報道，人源CD8T細胞擴增的可能原因：(1)移植受體為免疫缺陷小鼠，其獲得性免疫功能完全消失，天然免疫功能也大部分受損，無法清除或抑制外源T細胞；(2)腫瘤組織中存活的人CD8 T表型多為記憶細胞，可通過識別腫瘤細胞表面抗原而活化增殖[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，移植后4～5周，外周血中人源T細胞比例達到峰值，隨后開始下降，移植后10周仍可檢測到人CD8 T細胞。由于移植物來源的TIL大多是經(jīng)歷腫瘤抗原的特異性活化的寡克隆，其識別小鼠組織而引發(fā)移植物抗宿主(graft versus host disease, GVDH)的能力有限[20]。一旦小鼠發(fā)生GVDH效應(yīng)后，可導致小鼠外周血中人源T細胞持續(xù)增加，直至小鼠發(fā)生死亡。本研究通過動態(tài)監(jiān)測移植瘤小鼠外周血T細胞比例的變化規(guī)律后，基本可以排除GVHD的作用。因此，筆者推測，擴增的T細胞可能是記憶T細胞識別腫瘤抗原后發(fā)生活化增殖所致。類似研究也報道，PDX模型中CD8 T細胞隨腫瘤進入小鼠后可在體內(nèi)存活63～290 d[21-22]，人CD8 T細胞存活的時間受腫瘤類型、腫瘤組織大小、取材部位及受體小鼠的狀態(tài)等多種因素影響。

綜上所述，本研究探索了人胃癌腫瘤組織來源的免疫PDX模型的構(gòu)建方案，提示該模型進行腫瘤免疫研究的最佳時間段，即移植后3～8周人源T細胞存活較多的階段。盡管免疫PDX模型仍存在諸多問題，但其仍是較為客觀地反映腫瘤患者體內(nèi)免疫微環(huán)境的實驗?zāi)Ｐ停赏茝V應(yīng)用于免疫治療藥物的機制研究與臨床前試驗。后續(xù)將進一步探索如何在免疫PDX模型腫瘤組織中更有效保留人源T細胞，避免T細胞外滲至外周血及其他免疫器官。