楊 凱 潘 穎 金 蕾

(1安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校；2安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 安徽合肥 230601)

CD14是一種膜糖脂酰肌醇錨定糖蛋白，屬于模式識(shí)別受體，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面，稱為膜CD14(membrane CD14，mCD14)[1]。mCD14能通過識(shí)別病原體相關(guān)成份繼而激活免疫細(xì)胞，引發(fā)宿主免疫炎癥，因此被認(rèn)為是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要介質(zhì)之一[2]。除表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，CD14分子還以另一種形式存在于人體血清或血漿之中，即可溶性CD14(soluble CD14，sCD14)，其主要來源于蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞膜表面CD14分子脫落或肝細(xì)胞的分泌[3]。mCD14與sCD14雖具有結(jié)構(gòu)同源性和功能相似性，但迄今為止對于sCD14研究的深度與廣度均遠(yuǎn)不及mCD14。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種環(huán)狀雙鏈DNA嗜肝病毒，其通過與肝細(xì)胞表面病毒受體結(jié)合，啟動(dòng)病毒感染過程；同時(shí)激活機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，導(dǎo)致肝臟局部免疫損傷[4]。隨著病情遷延不愈，部分患者由急性HBV感染逐步發(fā)展為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭甚至肝細(xì)胞癌[5]。其中，肝臟炎癥和纖維化是慢性HBV感染疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素。一方面，肝臟炎癥激活肝星狀細(xì)胞，通過細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝細(xì)胞周圍過度沉積，開始重建肝組織結(jié)構(gòu)并逐步形成肝纖維化[6]；另一方面，隨著ECM沉積增多，肝纖維化轉(zhuǎn)化為肝硬化階段，改變了肝臟正常組織結(jié)構(gòu)及血流動(dòng)力學(xué)，從而導(dǎo)致病程進(jìn)展與病情惡化。2019年版中國《慢性乙型肝炎防治指南》明確提出“肝組織學(xué)顯示明顯的肝臟炎癥(≥G2)或纖維化(≥S2)，疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)較大，建議抗病毒治療”[7]。因此，準(zhǔn)確預(yù)測CHB肝臟炎癥和纖維化等級對于臨床評估患者病情和抗病毒指征具有重要義。

目前已知，CD14作為免疫炎癥介質(zhì)，血清sCD14含量與CHB患者疾病進(jìn)展密切相關(guān)，然而其與肝臟炎癥和纖維化關(guān)系尚未清楚。為此，本研究通過比較分析不同肝臟炎癥與纖維化等級的CHB患者血清sCD14含量，探討血清sCD14能否作為新型生物標(biāo)志物預(yù)測肝臟炎癥與纖維化等級。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 以2013年5月至2019年4月期間安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染科初診未治療256例CHB患者為研究對象，所有患者均接受肝穿刺病理檢查；同期選取與研究對象男/女性別比、年齡匹配的210名健康體檢人群為對照。CHB患者(實(shí)驗(yàn)組)中，男174例，女82例，平均年齡37.68±11.24歲；對照組中，男153例，女57例，平均年齡36.21±12.37歲。初診未治療CHB患者診斷標(biāo)準(zhǔn)和HBeAg陰性/陽性CHB患者劃分標(biāo)準(zhǔn)均依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》(2019年版)，同時(shí)排除合并丙型肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化、急慢性肝衰竭、肝細(xì)胞癌及酒精性脂肪肝等其它肝臟疾病。肝穿刺病理結(jié)果參照Scheuer評分系統(tǒng)診斷肝臟炎癥和纖維化等級，不同肝臟組織損傷程度分別以炎癥分級(G0、G1、G2、G3和G4)和纖維化分期(S0、S1、S2、S3和S4)表示。

1.1.2儀器與試劑 奧林巴斯公司Olympus AU5800自動(dòng)生化分析儀及原裝配套試劑測定血清白蛋白(ALB)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和總膽紅素(TBil)含量；Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀及原裝配套試劑測定全血血小板(PLT)和白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)；全自動(dòng)免疫分析儀ARCHITECT i2000及原裝配套試劑測定血清乙型肝炎S抗原(HBsAg)和乙型肝炎E抗原(HBeAg)含量；Qiagen Rotor-Gene Q Cycler熒光定量PCR儀及原裝配套試劑測定血清HBV DNA含量；血清sCD14檢測采用人sCD14 ELISA試劑盒(R&D Systems USA)。

1.2方法

1.2.1檢測方法 血清ALB、ALT、AST和TBil含量檢測分別采用溴甲酚綠比色法、紫外-乳酸脫氫酶法、蘋果酸脫氫酶法和重氮鹽法；全血PLT和WBC計(jì)數(shù)分別運(yùn)用電阻抗法和流式細(xì)胞術(shù)法；血清HBsAg和HBeAg含量檢測均使用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析方法；血清HBV DNA和sCD14含量分別應(yīng)用熒光定量PCR法和ELISA法。

1.2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 連續(xù)變量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表述，以SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。分類變量數(shù)據(jù)比較采用卡方檢驗(yàn)，連續(xù)變量數(shù)據(jù)比較運(yùn)用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，變量間相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析。運(yùn)用多因素Logistic回歸方程篩選肝臟炎癥與纖維化等級相關(guān)獨(dú)立因素，同時(shí)以受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)評估血清sCD14預(yù)測肝臟炎癥與纖維化等級的臨床價(jià)值。p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 CHB患者和健康對照人群血清sCD14含量的差異

CHB患者和健康對照人群的男/女性別比、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。CHB患者血清ALT和AST含量顯著高于對照人群，其他指標(biāo)在CHB患者與對照人群間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CHB患者和健康對照血清sCD14含量分別為13.97(8.56～18.35)ng/mL和24.60(15.39～41.93)ng/mL且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，即CHB患者血清sCD14較對照人群顯著升高(p<0.01)。然而，HBeAg陰性CHB患者和HBeAg陽性CHB患者血清sCD14含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。詳見表1和圖1。

表1 健康對照與研究對象的一般資料

圖1 血清sCD14在健康對照、CHB患者和HBeAg陰性/陽性CHB患者中含量差異

2.2 CHB患者血清sCD14含量與肝臟炎癥分級與纖維化分期的關(guān)系

依據(jù)Scheuer評分系統(tǒng)，不同肝臟炎癥分級的患者數(shù)分布如下：G1患者87例、G2患者109例、G3患者53例和G4患者7例；不同臟纖維化分期的患者數(shù)分布如下：S0/1患者93例、S2患者138例、S3患者14例和S4患者11例。G1、G2、G3和G4患者血清sCD14含量分別為9.42(7.48～13.23)ng/mL、17.96(11.24～26.84)ng/mL、23.50(19.92～35.55)ng/mL和30.82(22.97～46.43)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)；S0/1、S2、S3和S4患者血清sCD14含量分別為11.85(8.25～16.98)ng/mL、18.29(12.48～27.98)ng/mL、20.62(17.85～31.06)ng/mL和32.44(20.64～44.91)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，見圖2。

圖2 血清sCD14在不同肝臟病變CHB患者中含量

2.3血清sCD14是預(yù)測CHB患者肝臟炎癥G≥2與纖維化S≥2的獨(dú)立因素

依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》(2019年版)，CHB患者肝臟炎癥≥G2)或纖維化≥S2是臨床抗病毒治療指征，將256例CHB患者劃分為

表2 預(yù)測CHB患者肝臟炎癥分級G≥2的獨(dú)立因素

表3 預(yù)測CHB患者肝臟纖維化分期S≥2的獨(dú)立因素

2.4 CHB患者血清sCD14評估肝臟炎癥G≥2與纖維化S≥2的臨床價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清sCD14含量預(yù)測CHB患者肝臟炎癥G≥2與纖維化S≥2的曲線下面積分別為0.762和0.684，見圖3。當(dāng)血清sCD14含量cut-off值為26.20 ng/mL時(shí)，診斷肝臟炎癥分級G≥2的CHB患者的靈敏度和特異性分別為72%和83%；當(dāng)血清sCD14含量cut-off值為25.85 ng/mL時(shí)，診斷肝臟纖維化分級S≥2的CHB患者的靈敏度和特異性分別為74%和60%。

圖3 血清sCD14預(yù)測CHB患者肝臟炎癥G≥2與纖維化S≥2的臨床價(jià)值

3討論

HBV作為一種嗜肝病毒，其感染人體后并非直接引起肝臟病變，而是通過誘導(dǎo)體內(nèi)機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)不完全激活和免疫紊亂等途徑間接損傷肝臟功能，從而出現(xiàn)肝組織炎癥和纖維化等病理改變。天然免疫系統(tǒng)包括巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、溶菌酶、補(bǔ)體和干擾素等，是機(jī)體抵抗HBV感染的“第一道防線”。一般認(rèn)為，HBV感染逃避天然免疫系統(tǒng)清除是維持病毒感染慢性化的重要原因之一[8]。然而最新研究顯示機(jī)體天然免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞卻能被HBV感染所激活并分泌大量的細(xì)胞因子[9]，提示巨噬細(xì)胞可能在慢性乙型肝炎發(fā)病及疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。sCD163和sCD14均是巨噬細(xì)胞激活重要標(biāo)志物，其中血清sCD163已被證實(shí)是慢性HBV患者肝臟炎癥分級和纖維化分期預(yù)測指標(biāo)[10]。然而，血清sCD14是否同樣可以作為評估CHB患者肝臟炎癥分級和纖維化分期的相關(guān)研究目前尚未見報(bào)道。

現(xiàn)有研究顯示，血清sCD14含量與慢性HBV感染患者免疫系統(tǒng)活性增強(qiáng)及慢性肝病疾病進(jìn)展密切相關(guān)[11，12]。在該研究中，發(fā)現(xiàn)CHB患者血清sCD14含量較健康人群顯著升高，然而HBeAg陰性CHB患者和HBeAg陽性CHB患者血清sCD14含量卻無顯著差異。究其原因，可能是陽性CHB處于慢性HBV感染的免疫清除期，患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)活性較高，肝臟炎癥顯著；而HBeAg陰性CHB則處于慢性HBV感染的再活動(dòng)期，患者的肝硬化和肝癌的發(fā)生率較高。此外，通過分析不同肝臟炎癥分級和纖維化分期患者血清sCD14含量，發(fā)現(xiàn)CHB患者血清sCD14含量隨著肝臟炎癥分級和纖維化分期的增高而顯著上升，提示血清sCD14可能具有間接反映肝臟損傷嚴(yán)重程度的重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

肝臟炎癥分級≥G2或纖維化分期≥S2是《慢性乙型肝炎防治指南》(2019年版)推薦的CHB患者抗病毒治療指征之一，而及時(shí)有效地抗病毒治療對于延緩或阻斷CHB患者的疾病進(jìn)程具有重要意義。目前，肝穿病理結(jié)果是肝臟炎癥分級和纖維化分期的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而肝穿作為有創(chuàng)操作存在一定風(fēng)險(xiǎn)，因此患者接受度較低[13]。為證實(shí)血清sCD14是否可以作為臨床評估CHB患者肝臟炎癥G≥2與纖維化S≥2的無創(chuàng)性指標(biāo)，進(jìn)一步研究血清sCD14與肝臟炎癥分級與纖維化分期的關(guān)系。結(jié)果顯示，無論是肝臟炎癥分級G≥2患者或纖維化分期S≥2患者，其血清sCD14含量顯著高于肝臟炎癥分級

綜上所述，血清sCD14水平與CHB患者肝臟炎癥和纖維化發(fā)生密切相關(guān)；通過多中心和大樣本驗(yàn)證后，有望成為CHB患者明顯的肝臟炎癥(≥G2)或纖維化(≥S2)無創(chuàng)診斷指標(biāo)，從而為臨床CHB的診治提供新的評判依據(jù)。