徐歡歡，李逸，高偉，王永勤，劉樂承

洋蔥γ-谷氨酰轉肽酶的克隆與鑒定

徐歡歡1,2，李逸1，高偉1，王永勤2，劉樂承1

1長江大學園藝園林學院，湖北荊州 434025；2北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/蔬菜種質(zhì)改良北京市重點實驗室，北京 100097

【】蔥屬植物代謝產(chǎn)生的蒜氨酸具有重要的藥學價值，γ-谷氨酰轉肽酶是蒜氨酸合成中作為脫谷氨酰化步驟的關鍵酶。研究洋蔥γ-谷氨酰轉肽酶基因的功能，揭示γ-谷氨酰轉肽酶在洋蔥蒜氨酸合成途徑中的作用，為體外合成蒜氨酸提供理論依據(jù)，為進一步深入研究洋蔥蒜氨酸合成機制奠定基礎。以洋蔥為材料，依據(jù)洋蔥RNA-seq數(shù)據(jù)庫設計引物，利用RT-PCR從洋蔥中克隆γ-谷氨酰轉肽酶基因，并進行生物信息學分析；構建CaMV 35S-AcGGT-GFP載體，利用微粒轟擊技術，以金粉-質(zhì)粒微載體轟擊洋蔥內(nèi)表皮細胞，構建帶有的釀酒酵母表達載體，轉化并誘導表達，利用γ-谷氨酰轉肽酶催化谷氨酰對硝基苯胺生成對硝基苯胺的方法測定轉入的釀酒酵母總蛋白的谷氨酰轉肽酶活性；利用實時熒光定量PCR方法分析該基因在洋蔥組織間差異表達模式；利用γ-谷氨酰轉肽酶催化谷氨酰對硝基苯胺生成對硝基苯胺的方法測定組織間內(nèi)源性轉肽酶酶活性。克隆獲得，長度為1 869 bp；生物學信息學分析顯示，洋蔥編碼622個氨基酸，蛋白保守結構域預測顯示具有谷氨酰轉肽酶結構域，二級結構主要以α-螺旋為主，跨膜區(qū)分析推測GGT蛋白具有跨膜區(qū)，氨基酸多重比對結果顯示植物中的GGT具有一定的保守性，進化分析表明AcGGT與大蒜AsGGT2親緣關系最接近。CaMV 35S-AcGGT-GFP融合蛋白的熒光信號位于液泡中，表明該基因編碼蛋白位于液泡。外源表達AcGGT蛋白的谷氨酰轉肽酶活性測定結果顯示，轉入的酵母谷氨酰轉肽酶活性顯著高于對照，表明編碼的蛋白具有轉肽酶活性。組織差異表達結果分析顯示，該基因的表達主要在葉鞘，鱗莖和葉鞘次之；不同組織谷氨酰轉肽酶活性顯示，在葉中活性最高，葉鞘次之。相關性分析顯示組織間谷氨酰轉肽酶活性與表達相關性不顯著?？寺×搜笫[。洋蔥蒜氨酸合成途徑中脫谷氨?；扔赟-加氧。的表達與洋蔥內(nèi)源性的谷氨酰轉肽酶活性相關性不顯著，洋蔥中可能存在多個谷氨酰轉肽酶基因。

洋蔥；γ-谷氨酰轉肽酶；生物信息學；亞細胞定位；真核表達；表達模式

0 引言

【研究意義】洋蔥（L.）是蔥屬二年生草本植物，富含多種活性物質(zhì)[1-4]。其中，含硫化合物是洋蔥風味物質(zhì)的主要成分，使洋蔥不僅具有食用價值還有藥用價值[5-6]。大量研究表明這類物質(zhì)具有抗氧化活性，并且在抗癌細胞增殖和降低糖尿病和心血管疾病的風險中起重要作用[7-11]。蒜氨酸是洋蔥中重要的含硫化合物，也是大蒜素合成的前體，γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）作為脫谷氨酰化酶參與蒜氨酸合成途徑[12-14]。因此，克隆洋蔥并鑒定功能，闡明該基因在蒜氨酸合成途徑中的作用，對利用分子設計育種改善洋蔥品質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】在蒜氨酸生物合成途徑中，GGT能夠催化γ-谷氨?；鶑摩?谷氨?；囊浦疗渌模功?谷酰胺半胱氨酸化合物脫去谷氨?；a(chǎn)生脫氧蒜氨酸（S-allyl-L-cysteine，SAC）[15-17]。因此，GGT作為脫谷氨?；竻⑴c蒜氨酸的合成，是蒜氨酸合成的重要步驟。前人利用(NH4)2SO4沉淀和疏水作用層析（苯基-瓊脂糖柱）的方法從枯草芽孢桿菌[18]、番茄果實[19]、香菇[20]、大蒜[21]和洋蔥[22-24]中純化獲得GGTs并對蛋白的部分特性進行了鑒定。這些研究中發(fā)現(xiàn)，GGT通常由1個主要亞基和1個次要亞基組成[24]。其中，大蒜GGTs相對分子質(zhì)量為68 kD，由2個異質(zhì)亞基54和14 kD組成[21]。在洋蔥中，發(fā)芽鱗莖的GGT由36—39 kD大亞基和25 kD小亞基組成，另一項研究發(fā)現(xiàn)休眠鱗莖中的GGTs為55 kD亞基和一個22 kD亞基。此外，研究還發(fā)現(xiàn)pH、金屬離子、氨基酸對洋蔥GGTs活性具有促進作用[23-24]。大蒜中已被鑒定了3個編碼GGTs的基因、和，相應的重組蛋白可以使γ-谷氨?；?S-烯丙基-L-半胱氨酸脫谷氨酰化，產(chǎn)生脫氧蒜氨酸[13]?！颈狙芯壳腥朦c】洋蔥中GGTs蛋白的部分特性已被鑒定，但編碼GGTs的基因及功能鑒定的研究卻鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究克隆，闡明該基因及編碼蛋白的理化性質(zhì)，并鑒定外源蛋白的谷氨酰轉肽酶活性，檢測在組織間的表達模式及組織間谷氨酰轉肽酶活性的差異，為后續(xù)GGTs特性的深入研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗所用洋蔥材料均為紫冠洋蔥，取自北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心基地。

1.1.2 試驗試劑 RNA提取試劑盒（Quick RNA Isolation Kit）購自北京華越洋生物科技有限公司；反轉錄試劑盒（Prime Script? 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、酵母轉化試劑盒（Yeastmaker? Yeast Transformation System2）購自上海寶生物有限公司；DNA marker、2×TransStart?FastPfu Fly PCR Mix、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒、蛋白定量試劑盒（Easy Protein Quantitative Kit）購自TransGen Biotech。無縫克隆試劑盒（2×Seamless Cloning Mix）、大量質(zhì)粒提取試劑盒購自（DP109-01）北京博邁德基因技術有限公司。

1.1.3 菌株及載體 pEASY-Blunt Zero載體、大腸桿菌感受態(tài)（Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell）購自TransGen Biotech；酵母菌株BY2777由NBRP（National BioResource Project）提供；pYES2、PYBA1332載體均由北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心公共平臺實驗室保存。

1.1.4 引物設計與合成 試驗所用引物均由Primer5.0軟件設計（表1），由博邁德生物科技公司（北京）合成。

1.2 洋蔥總RNA的提取和cDNA合成

選擇無病蟲害的洋蔥鱗莖，用RNA提取試劑盒提取洋蔥總RNA，并用微量紫外分光光度計檢測RNA的質(zhì)量，反轉錄合成cDNA。

1.3 洋蔥AcGGT的克隆

根據(jù)北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心公共平臺實驗室RNA-Seq數(shù)據(jù)庫獲得序列，用primer5.0軟件設計引物（表1）擴增的編碼區(qū)序列。PCR反應體系為洋蔥cDNA 1 μL、10 μmol·L-1的上下游引物（GGT-F和GGT-R）各1 μL、2×TransStart?FastPfu Fly PCR Mix10 μL，加水補至20 μL。PCR擴增程序為94℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃2 min，30個循環(huán)；72℃7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，拍照，切膠并利用膠回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物的回收，純化回收后連接到載體pEASY-Blunt Zero中。

轉化篩選后，將陽性克隆送北京博邁德生物科技公司測序，測序得到的序列在NCBI上進行比對。利用DNAMAN軟件及NCBI將測序驗證正確的序列進行拼接，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST對其核苷酸序列和推導氨基酸序列進行比對。

1.4 生物信息學分析

利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對氨基酸序列的蛋白質(zhì)分子量和等電點進行分析；利用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線分析蛋白質(zhì)的信號肽；利用TMHMM Server V.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測蛋白質(zhì)的跨膜結構域；利用DNAMAN對編碼氨基酸序列進行同源性比對，利用MEGA5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 AcGGT亞細胞定位載體構建及分析

用Ⅰ和Ⅰ雙酶切PYBA1332植物表達載體，將pEASY-T5-質(zhì)粒作為模板，使用PYBA1332-GGT-F及PYBA1332-GGT-R進行擴增，根據(jù)BM無縫克隆試劑盒提供的方法將回收的PCR產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物進行連接。連接完成后使用Trans-T1感受態(tài)進行轉化，篩選完成后將陽性克隆送博邁德生物科技公司測序，根據(jù)測序結果驗證PYBA1332-GGT- EGFP與預期結果一致。

使用大量質(zhì)粒提取試劑盒分別提取PYBA1332空載體以及PYBA1332-GGT-EGFP質(zhì)粒，制作金粉-質(zhì)粒微載體，靶距為9 cm，氦氣壓力為1350PSI以金粉-質(zhì)粒微載體在基因槍介導下轟擊已預培養(yǎng)8 h的洋蔥內(nèi)表皮（轟擊條件為：氦氣壓為1 350 Psi，真空度為28 kPa，轟擊聚類為9 cm），25℃培養(yǎng)12 h后，利用OLYMPUSFV300激光共聚焦顯微鏡觀察，并拍照。

1.6 釀酒酵母表達載體pYES2-GGT的構建

使用Ⅰ及Ⅰ雙酶切pYES2釀酒酵母表達載體，將pEASY-T5-GGT質(zhì)粒作為模板，使用pYES2-GGT-F及pYES2-GGT-R進行擴增，BM無縫克隆試劑盒將回收的PCR產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物進行連接。連接完成后使用Trans-T1感受態(tài)進行轉化，篩選完成后將陽性克隆送博邁德生物科技公司測序，根據(jù)測序結果驗證pYES-GGT與預期結果一致后，提取質(zhì)粒備用。

1.7 AcGGT的真核表達與總蛋白質(zhì)的提取

依據(jù)酵母轉化試劑盒(Yeastmaker? Yeast Transformation System2)將pYES2和pYES2-GGT轉入釀酒酵母BY2777酵母中，利用SD Base-Ura篩選陽性克隆。培養(yǎng)2—3 d后挑選單菌落利用酵母陽性克隆快速檢測試劑盒進行鑒定，鑒定完畢后使用2%D-半乳糖代替葡萄糖的SD Base-Ura培養(yǎng)2 d?？偟鞍椎奶崛“凑毡本┛醽聿萍加邢薰痉亲冃越湍傅鞍滋崛≡噭┖刑崛?，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 重組AcGGT酵母總蛋白的定量與酶活性測定

依據(jù)Bradford[25]方法定量酵母總蛋白。通過分析酵母總蛋白中γ-谷氨?；衔锂a(chǎn)生的脫谷氨酰化化合物的量來進行GGT酶活性的測定。在6 h的孵育期間，脫谷氨?；幕衔锏臄?shù)量線性增加。根據(jù)Orlowski等[10]方法，通過分光光度法確定以γ-谷氨酰對硝基苯胺為底物的脫谷氨?；钚?。

1.9 不同組織AcGGT相對表達量及谷氨酰轉肽酶測定

RNA的提取與cDNA的合成與1.2.1描述一致。實時熒光定量PCR總反應體系為：10 μmol·L-1上、下游引物各0.8 μL、2×SYBR Green Master Mix 10 μL、cDNA模板1 μL和ddH2O 7.4 μL。反應條件為95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 50 s，共40個循環(huán)。根據(jù)熒光定量PCR測定Ct值，利用2-ΔΔCT法計算相對表達量。

精確稱取約0.1 g洋蔥組織，加提取液1.0 mL充分研磨，于4℃，10 000 r/min離心15 min，取粗酶液上清液待測。通過分析粗酶液上清中γ-谷氨?；衔锂a(chǎn)生的脫谷氨酰化化合物的量來進行GGT酶活性的測定。

2 結果

2.1 AcGGT的克隆

以cDNA為模板，利用特異引物在預先篩選的退火溫度下進行PCR擴增，得到約1 900 bp產(chǎn)物（圖1），通過測序得到1 869 bp的CDS序列，經(jīng)NCBI比對，發(fā)現(xiàn)與已報道的大蒜（GenBank：JQ409456.1）相似性達96%。在NCBI的ORF finder查找開放閱讀框并翻譯其對應的氨基酸，結果顯示，所克隆得到的序列具有一個1 869 bp完整的開放閱讀框，推導編碼622個氨基酸（圖2），命名為。

2.2 AcGGT的生物信息學分析

采用ProtParam在線分析工具，對AcGGT蛋白的理化性質(zhì)進行預測，結果顯示，該蛋白相對分子質(zhì)量為67.7，等電點（）為6.07，分子式為C3024H4755N811O895S28，不穩(wěn)定指數(shù)為33.37，脂肪族指數(shù)為89.25。通過氨基酸多重比對結果發(fā)現(xiàn)，植物中的GGT除N端外都具有一定的保守性（圖3），與前人預測的N-連接糖基化位點相似，并且也具有保守的蛋白裂解酶位點。

M：DL5000 DNA Marker；1—3：AcGGT

圖2 AcGGT編碼區(qū)序列

NCBI保守結構域預測分析結果顯示，編碼蛋白從氨基酸第66—622位為一個γ-谷氨酰轉肽酶超級結構域（圖4-A）。利用SOPMA對AcGGT蛋白二級結構進行分析，結果表明，該蛋白二級結構的形式及其所占比例分別為46.02%α-螺旋、15.17%延伸鏈、6.94%β-轉角和31.88%無規(guī)則卷曲（圖4-B）；利用TMHMM Server V.2.0對AcGGT蛋白跨膜區(qū)進行預測，分析顯示該蛋白第24—46位具有一個跨膜結構（圖5）。

利用MegA6軟件對21種GGT氨基酸序列進行同源性比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。結果表明，洋蔥GGT氨基酸序列與大蒜AsGGT1、AsGGT2、AsGGT3有較高同源性，在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離AsGGT2最近，GGT發(fā)育樹與生物進化的物種樹基本一致，符合物種進化規(guī)律，說明GGT基因編碼區(qū)在物種間具有保守性。

2.3 AcGGT亞細胞定位載體的構建及分析

為了預測AcGGT編碼蛋白在大蔥中的亞細胞定位情況，利用基因槍介導在洋蔥內(nèi)表皮中瞬時表達帶有GFP的，將轟擊過后的洋蔥內(nèi)表皮組織在25℃暗培養(yǎng)12 h，在激光共聚焦顯微鏡下掃描拍攝其在細胞中的定位（圖7）。結果發(fā)現(xiàn)，帶有GFP的AcGGT重組融合蛋白在洋蔥液泡中具有微弱信號，這一結果可能是由于的序列較長，含有靶向細胞器的信號序列，這與大蒜AsGGT2定位于液泡中的結果一致。

黑線：預測的GGT蛋白信號肽；*：預測的N-連接糖基化位點；箭頭：表示大亞基和小亞基之間的保守蛋白酶切割位點

A：γ-谷氨酰轉肽酶結構域預測；B：γ-谷氨酰轉肽酶二級結構預測

圖5 洋蔥AcGGT編碼蛋白的跨膜結構預測

*：洋蔥AcGGT *：Allium cepa AcGGT

2.4 AcGGT在酵母中的表達及活性分析

根據(jù)γ-谷氨酰轉肽酶能夠將谷氨酰對硝基苯胺中γ-谷氨?；D移給N-甘氨酰甘氨酸，生成對硝基苯胺的方法測定酵母總轉肽酶活性。按照上述方法，37℃孵育6 h后，轉入的酵母總蛋白酶液催化生成0.76 μmol·mg-1對硝基苯胺；而轉入PYES2空載體的催化生成0.54 μmol·mg-1（圖8）。轉入的酵母總蛋白的谷氨酰轉肽酶活性顯著高于未轉入外源基因的酵母總蛋白，結果表明，AcGGT蛋白具有谷氨酰轉肽酶功能。

圖7 35S-GGT-GFP 在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位分析

**：與對照組顯著性差異（p<0.01）

2.5 AcGGT在洋蔥中的組織表達差異性及內(nèi)源性谷氨酰轉肽酶活性分析

利用qRT-PCR方法檢測在洋蔥不同組織中的表達（圖9）。結果表明，在葉中的表達量遠遠高于在其他組織中的表達量，其次是葉鞘，而在鱗莖中幾乎不表達。

根據(jù)上述方法測定洋蔥不同組織谷氨酰轉肽酶活性，結果顯示，在葉中活性最高，葉鞘和鱗莖次之。

相關性分析顯示在洋蔥中的表達與內(nèi)源性轉肽酶活性相關性不顯著（=0.269，＞0.05）。

3 討論

蒜氨酸是蔥屬植物中富含的一類含硫化合物，也是大蒜素合成的主要底物[26]。前人根據(jù)放射性追蹤法及化學分析的結果中提出的從大蒜中的半胱氨酸生物合成蒜氨酸的途徑，其中研究最廣泛的步驟是生物合成中間體中去除γ-谷氨酰基，γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）作為脫谷氨酰化酶參與蒜氨酸合成[26-29]。因此，γ-谷氨酰轉肽酶在蒜氨酸合成途徑中起著關鍵作用[24,27,29]。本研究克隆了一個編碼洋蔥GGT蛋白的一個基因，并利用生物信息學分析鑒定了該基因的基本性質(zhì)，通過異源表達發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白具有轉肽酶功能。

在前人提出的蒜氨酸生物合成途徑中，根據(jù)脫谷氨?；蚐-加氧反應順序的不同，從中間體γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸到蒜氨酸有2條不同路線[13,30-31]。大蒜AsGGT1、AsGGT2和AsGGT3對γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸具有脫谷氨酰化活性，而這些GGT對γ-谷氨酰S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜幾乎沒有脫谷氨基活性，表明大蒜蒜氨酸的合成主要是先脫谷氨?；缓蠹友鹾铣伤獍彼醄13]。在休眠的洋蔥鱗莖中的GGTs對蒜氨酸的生物合成中間體表現(xiàn)出很高的底物特異性，證實GGT催化γ-谷氨酰S-烯丙基-L-半胱氨酸生物合成中的脫谷氨?；挠^點[23]。然而，在發(fā)芽的洋蔥鱗莖中純化的GGTs對谷胱甘肽和谷胱甘肽S-結合物表現(xiàn)出很高的親和力，但利用γ-谷氨酰-S-丙烯-L-半胱氨酸亞砜作為底物的親和力較差，這表明洋蔥至少有2個不同的GGT蛋白，它們在體內(nèi)具有不同的功能[24]。此外，在大蒜的膨大時期轉錄組測序結果中顯示，在大蒜鱗莖膨大時期中均處于高度表達狀態(tài)，表明該基因在大蒜鱗莖膨大過程中具有重要作用[32]。在本研究中鑒定的編碼洋蔥GGT的基因，該基因與同源性最高，進化分析顯示與歸于同一分支。由此，表明該基因在洋蔥中的蒜氨酸合成途徑中的作用與大蒜中一致。綜上所述，推測在洋蔥蒜氨酸合成過程中，γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸到蒜氨酸的順序是脫谷氨?；扔赟-加氧反應。

另外，通過分析該基因的組織表達水平以及谷氨酰轉肽酶活性發(fā)現(xiàn)，洋蔥的表達與谷氨酰轉肽酶活性相關性不顯著，所以推測洋蔥中可能存在多個谷氨酰轉肽酶基因。然而，編碼洋蔥GGTs蛋白的其他基因有待進一步研究。

4 結論

克隆了洋蔥，并提供了外源表達酶促反應數(shù)據(jù)。洋蔥蒜氨酸合成途徑中脫谷氨酰化先于S-加氧；的表達與洋蔥內(nèi)源性的谷氨酰轉肽酶活性相關性不顯著，表明洋蔥中可能存在多個谷氨酰轉肽酶基因。

[1] Jones M G, Hughes J, Tregova A, Milne J, Tomsett A B, Collin H A. Biosynthesis of the flavour precursors of onion and garlic. Journal of Experimental Botany, 2004(404): 1903-1918.

[2] Beesk N, Perner H, Schwarz D, George E, Kroh L W, Rohn S. Distribution of quercetin-3,4′-O-diglucoside, quercetin-4′- O-monoglucoside, and quercetin in different parts of the onion bulb () influenced by genotype. Food Chemistry, 2010, 122(3): 566-571.

[3] 張新茹, 楊曉虹, 王天曉. 蔥屬植物中甾體皂苷及其藥理作用最新研究進展. 解放軍藥學學報, 2009, 25(2): 165-169.

ZHANG X R, YANG X H, WANG T X. Research progress of steroidal saponins and their pharmacological effects in Allium. Pharmaceutical Journal of Chinese People's Liberation Army, 2009, 25(2): 165-169. (in Chinese)

[4] 馮長根, 吳悟賢, 劉霞, 李生才. 洋蔥的化學成分及藥理作用研究進展. 上海中醫(yī)藥雜志, 2003(7): 63-65.

Feng C G, Wu W X, Liu X, Li S C. Chemical constituents and pharmacological effects of onion. Shanghai Journal of traditional Chinese medicine, 2003(7): 63-65. (in Chinese)

[5] 弓志青, 靳瓊, 陳相艷, 王文亮. 不同品種洋蔥粉營養(yǎng)成分分析. 食品科學技術學報, 2014, 32(5): 46-49.

Gong Z Q, Jin Q, Chen X y, Wang W L. Analysis of nutritional components of different onion powder. Journal of food science and technology, 2014, 32(5): 46-49. (in Chinese)

[6] 陳亦輝, 王衛(wèi)東, 孫月娥. 洋蔥中活性物質(zhì)及生理藥理作用研究進展. 中國調(diào)味品, 2015, 40(4): 129-132+140.

Chen Y H, Wang W D, Sun Y E. Research progress on active substances and physiological and pharmacological effects of onion. Chinese condiment, 2015, 40(4): 129-132+140. (in Chinese)

[7] NAOKO Y, KAZUKI S. Biosynthesis of S-Alk(en)yl-l-Cysteine Sulfoxides in Allium: Retro Perspective. Sulfur metabolism in higher plants. Fundamental, Environmental and Agricultural Aspects, 2017: 49-60

[8] Conrad M, Sandin A, Forster H, Seiler A, Frijhoff J, Dagnell M, Bornkamm G W, R?dmark O, Hooft van Huijsduijnen R, Aspenstr?m P, B?hmer F, Ostman A. 12/15-lipoxygenase-derived lipid peroxides control receptor tyrosine kinase signaling through oxidation of protein tyrosine phosphatases. Proceedings of the National Academy of sciences of the USA, 2010, 107(36): 15774-15779.

[9] Tian S y, Hao C c, Xu G k, Yang J j, Sun R g. Optimization conditions for extracting polysaccharide from Angelica sinensis and its antioxidant activities. Journal of Food and Drug Analysis, 2017, 25(4): 766-775

[10] Orlowski M, Meister A. Gamma-glutamyl-p-nitroanilide: a new convenient substrate for determination and study of l- and d-gamma-glutamyltranspeptidase activities. Biochimica et Biophysica Acta- Proteins and Proteomics, 1963, 73(4): 679-681.

[11] Naoaki M, Nagatoshi I, Norbert W. Aged garlic extract inhibits CD36 expression in human macrophages via modulation of the PPARgamma pathway. Phytotherapy Research, 2010, 24(4): 602-608.

[12] 王輝, 李景明, 馬釗. 洋蔥中含硫化合物的生理功效. 食品工業(yè)科技, 2005, 26(5): 187-189.

Wang H, Li J M, Ma Z. Physiological effects of sulfur compounds in onion. Food industry science and technology, 2005, 26(5): 187-189. (in Chinese)

[13] Yoshimoto N, Yabe A, Sugino Y. Garlic γ-glutamyl transpeptidases that catalyze deglutamylation of biosynthetic intermediate of alliin. Frontiers in Plant science, 2014, 5: 758.

[14] Petropoulos S, Di Gioia F, Ntatsi G. Vegetable organosulfur compounds and their health promoting effects. Current Pharmaceutical Design, 2017, 23(19): 2850-2875.

[15] Hughes J, Tregova A, Tomsett A B, Jones M G, Cosstick R, Collin H A. Synthesis of the flavour precursor, alliin, in garlic tissue cultures. Phytochemistry, 2005, 66(2): 187-194.

[16] Yu T H, Wu C M, Ho C T. Meat-like flavor generated from thermal interactions of glucose and alliin or deoxy-alliin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42(4): 1005-1009.

[17] Lanzotti V, Scala F, Bonanomi G. Compounds from Allium species with cytotoxic and antimicrobial activity. Phytochemistry Reviews, 2014, 13(4): 769-791.

[18] Shuai Y, Zhang T, Mu W, Jiang B. Purification and Characterization of γ-Glutamyl transpeptidase from Bacillus subtilis SK11.004.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(11): 6233-6238.

[19] Melinda N M, Janet P S. Purified γ-glutamyl transpeptidases from tomato exhibit high affinity for glutathione and glutathione S-conjugates. Plant physiology, 2000, 122(4): 1417-1426.

[20] Li J, Huang J, Yin J, Wu N, Song J, Zhang L, Jiang T. Rapid purification and characterization of γ‐glutamyl‐transpeptidase from shiitake mushroom (). Journal of Food science, 2012, 77(4/6): C640-C645.

[21] Fujii T, Matsutomo T, Kodera Y. Changes of S- Allylmercaptocysteine and γ-Glutamyl- S-allylmercaptocysteine contents and their putative production mechanisms in garlic extract during the aging process. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(40): 10506-10512.

[22] Urs W, Shaw M L, Lancaster J E. Effect of freezing upon alliinase activity in onion extracts and pure enzyme preparations. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1994, 64(3): 315-318.

[23] Sun Y, Hu J, Wang W, Zhang B, Shen Y. Characterization of γ-lutamyl transpeptidases from dormant garlic and onion bulbs. Food Science and Nutrition, 2019, 7(2): 499-505.

[24] Shaw M L, Pither-Joyce M D, Mccallum J A. Purification and cloning of a gamma-glutamyl transpeptidase from onion (). Phytochemistry, 2005, 66(5): 515-522.

[25] Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgam quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1/2): 248-254.

[26] SUZUKI T, SUGII M, KAKIMOTO T. Metabolic incorporation of L-valine-[14C] into S-(2-carboxypropyl) glutathione and S-(2- carboxypropyl) cysteine in garlic. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1962, 10(4): 328-331.

[27] Bayan L, Koulivand P H, Gorji A. Garlic: A review of potential therapeutic effects. Avicenna Journal of Phytomedicine, 2014, 4(1): 1-14.

[28] Turnbull A, Galpin I J, Collin H A, Smith J L. Comparison of the onion plant () and onion tissue culture: III. Feeding of 14C labeled precursors of the flavor precursor compounds. New Phytologist, 2006, 85(4): 483-487.

[29] Lancaster J E, Shaw M L. γ-Glutamyl peptides in the biosynthesis of-alk(en)yl-l-cysteine sulphoxides (flavour precursors) in. Phytochemistry, 1989, 28(2): 455-460.

[30] Dong Y, Lisk D, Block E, Ip C. Characterization of the bi-ological activity of gamma- glutamyl- Se- methylselenocysteine: A novel, naturally occurring anticancer agent from garlic. Cancer Research, 2001, 61(7): 2923-2928.

[31] Lancaster J E, And M L S, Randle W M. Differential hydrolysis of alk(en)yl cysteine sulphoxides by alliinase in onion macerates: flavour implications. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1998, 78(3): 367-372

[32] Sun X, Zhu S, Li N. A chromosome-level genome assembly of garlic (L.) provides insights into genome evolution and allicin biosynthesis. Molecular Plant, 2020, 13(9): 1328-1339.

Cloning and identification of γ-glutamyl transpeptidasegene from onion ()

Xu Huanhuan1,2, Li Yi1, Gao Wei1, Wang Yongqin2, Liu Lecheng1

1College of horticulture and Gardening, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei;2Vegetable Research Center, Beijing Academy of agriculture and forestry/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural (North China), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, P.R. China/Beijing Key Laboratory of Vegetable Germplasm Improvement, Beijing 100097

【】Alliin metabolized by Allium plants had important pharmaceutical value. γ-glutamyl transpeptidase was a key enzyme in the deglutamylation step of the process of alliin synthesis. Studying the function of γ-glutamyl transpeptidase gene in onion can reveal the role of γ-glutamyl transpeptidase in alliin synthesis pathway, providing theoretical basis for alliin synthesisand laying a foundation for further study on alliin synthesis mechanism. 【】Using onion as material, the primers were designed according to onion RNA-seq database, and the gene, γ-glutamyl transpeptidase, was cloned from onion by RT-PCR and analyzed by bioinformatics. The CAMV 35S-AcGGT-GFP vector was used to bombard onion inner epidermis cells with gold powder plasmid microcarrier by particle bombardment technology, and the subcellular localization ofwas determined by fusion green fluorescent expression protein. The Saccharomyces cerevisiae expression vector withwas constructed, transforming and inducing the expression of, and using the method of transforming glutamyl-p-nitroaniline to p-nitroaniline by γ-glutamyl transpeptidase to determine the glutamyl transpeptidase activity of the total protein of Saccharomyces cerevisiae transferred into. Real time quantitative PCR was used to analyze the differential expression pattern of the gene in onion tissues. The activity of endogenous transpeptidase in onion tissues was determined by the method of γ-glutamyl transpeptidase catalyzing the production of p-nitroaniline from p-nitroaniline. 【】was cloned and its length was 1 869 bp. Bioinformatics analysis showed thatencoded 622 amino acids, protein domain prediction showed that it had glutamyl transpeptidase domain, secondary structure was mainly α - helix, transmembrane region analysis suggested that GGT protein had transmembrane region, amino acid multiple alignment results showed that GGT in plants had certain conservation, evolutionary analysis showed thatwas related to garlic, and the relationship is closest. The fluorescence signal of CaMV 35S-AcGGT-GFP fusion protein was located in the vacuole, indicating that the protein encoded by CaMV 35S-AcGGT-GFP was located in the vacuole. The results of glutamyl transpeptidase activity assay showed that the glutamyl transpeptidase activity of yeast transformed withwas significantly higher than the control, indicating that the protein encoded byhad transpeptidase activity. The results of differential expression analysis ofshowed that the expression ofwas mainly in leaf sheath, bulb and leaf sheath followed by. The activity of glutamyl transpeptidase in different tissues, the highest activity in leaf, followed by leaf sheath. Correlation analysis showed that there was no significant correlation between the activity of transglutaminase and the expression of. 【】The enzymatic reaction data of exogenousexpression were obtained. the deglutination of alliin synthesis pathway preceded S-oxygenation; there was no significant correlation betweenexpression and endogenous transglutaminase activity in onion, suggesting that there may be multiple transglutaminase genes in onion.

onion; γ-glutamyl transpeptidase; bioinformatics; subcellular localization; eukaryotic expression; expression pattern

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.012

2020-11-12；

2021-01-08

國家自然科學基金（31972409，31572119）、北京市農(nóng)林科學院科技創(chuàng)新能力項目（KJCX20200113）

徐歡歡，E-mail：sr19951010@126.com。通信作者王永勤，E-mail：wangyqly@163.com。通信作者劉樂承，E-mail：516119@yangtzeu.edu.cn

（責任編輯 李莉）