劉亞南 ，楊 雙 ，董 瑋 ，李崇陽 ，徐世蓮

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，云南 昆明 650500；2）云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨傷科，云南 昆明 650041；3）云南省第二人民醫(yī)院腫瘤科，云南 昆明 650021）

國際疼痛研究會2011年將由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛定義為神經(jīng)病理性痛[1]。目前臨床治療神經(jīng)痛的藥物主要包括阿片類鎮(zhèn)痛劑、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartic acid，NMDA）受體阻斷劑、鈉離子通道阻斷劑等。這些藥物對某些病人能產(chǎn)生短時的鎮(zhèn)痛作用，但其副作用也是十分明顯的，如鎮(zhèn)靜、惡心、腹瀉、眩暈以及阿片類鎮(zhèn)痛劑長期應(yīng)用可發(fā)生耐受、心理/生理依賴、戒斷綜合征和自身覓藥行為。

小針刀（Small needle knife）療法是我國朱漢章教授在1976年總結(jié)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，吸收現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)及西醫(yī)學(xué)的新成果，將手術(shù)刀的“刀”與針灸的“針”巧妙融為一體的先進(jìn)治療方法[2]。該療法將小針刀刺入到病變組織進(jìn)行松解、切割和剝離，以達(dá)到止痛祛病的目的[3]，具有見效快、方法簡便、療程短、痛苦小、價格低、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，因此在臨床應(yīng)用越來越廣泛。與其臨床應(yīng)用蓬勃發(fā)展的良好態(tài)勢相比，針刀療法的實(shí)驗(yàn)研究相對滯后。研究報道針刀治療可促進(jìn)內(nèi)源性阿片肽、β-內(nèi)啡呔、亮氨酸-腦腓呔釋放[4-5]，從而參與內(nèi)源性鎮(zhèn)痛。

甘丙肽（Galanin）是一種由29個（人類為30個）氨基酸組成的神經(jīng)活性肽，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織。甘丙肽通過激活其受體，具有神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、攝食和代謝、認(rèn)知等多種生物學(xué)作用。甘丙肽受體（galanin receptors，GalRs）有3種：GalR1、GalR2、GalR3。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明：在伏核，甘丙肽通過激活其受體對神經(jīng)病理性痛具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)研究針刀治療神經(jīng)痛是否通過促進(jìn)伏核神經(jīng)細(xì)胞甘丙肽的釋放，轉(zhuǎn)而激活其受體來完成。

伏隔核（nucleus accumbens，NAc），也稱為伏核，位于尾狀核頭部、殼核的前部，側(cè)面與透明隔相接，左右對稱，在大腦獎賞效應(yīng)、藥物成癮、認(rèn)知等功能活動中起重要作用[8-9]。越來越多的研究表明，伏核在痛覺調(diào)制中具有重要作用[10-11]。本研究通過坐骨神經(jīng)痛大鼠模型，檢測針刀治療對神經(jīng)痛大鼠伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2的表達(dá)的影響，并于伏核內(nèi)注射甘丙肽受體的非特異性阻斷劑Galantide及GalR2的特異性阻斷劑M871，研究甘丙肽及GalR2介導(dǎo)針刀療法對神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用，為針刀治療神經(jīng)痛的作用機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)使用體重（180～220）g的SD雄性大鼠，體重：（180～250）g年齡：（1.5～2）月。購于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)期間大鼠分籠飼養(yǎng)，自由取食和飲水，自然光照，室溫維持在適宜溫度（22±1）℃。所有動物實(shí)驗(yàn)步驟均遵循國際疼痛研究協(xié)會以及昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會管理規(guī)定。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品M871（[galanin（2-13）-Glu-His-（Pro）3-（Ala-Leu）2-Ala-amide]，Tocris，美國）；Galantide（[galanin（1-13）-substrate P（5-11）amide]，MCE，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 行為學(xué)測試方法使用智能熱板儀（YLS-6B，濟(jì)南益延科技有限公司）測試大鼠對傷害性熱刺激誘導(dǎo)的后爪縮爪潛伏期（hind paw withdrawal latency，HWL）。熱板溫度維持在（52±0.2）℃。使用Randall-Siletto痛覺測試儀（37 215，意大利UGO Basil 公司）測試大鼠對傷害性機(jī)械壓力刺激誘導(dǎo)的后爪縮爪閾值（hind paw withdrawal threshold，HWT）。

實(shí)驗(yàn)前對大鼠進(jìn)行5 d的行為學(xué)測試訓(xùn)練。每天訓(xùn)練3輪，每輪3次。訓(xùn)練后大鼠HWL保持在3～6 s之間，HWT保持在4～7 g之間。每次測試要求不超過15 s或15 g，以防止造成大鼠后爪組織損傷。

1.2.2 神經(jīng)病理性痛動物模型的構(gòu)建采用坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎（chronic constriction injury，CCI）制作神經(jīng)病理性痛動物模型[12]。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）進(jìn)行麻醉，在其左側(cè)大腿中部暴露（8～10）mm長的一段坐骨神經(jīng)，用4號羊腸線每隔（1.0～1.5）mm輕度結(jié)扎神經(jīng)，共結(jié)扎4圈。結(jié)扎時看見后肢抽動，神經(jīng)輕度凹陷即可，最后用4號絲線縫合皮膚。

1.2.3 伏核埋管及微量注射CCI大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，將其固定于腦立體定位儀，根據(jù)大鼠腦定位圖譜確定伏核定位點(diǎn)（B：+1.7 mm，L or R：1.6 mm，V：7.0 mm。B：前囟向前（+）或向后（-），L or R：中線旁開，V：顱骨平面向下）。標(biāo)記位點(diǎn)，用骨鉆在標(biāo)記點(diǎn)鉆孔，將外徑0.8 mm的不銹鋼套管垂直插入，并用牙科水泥固定套管。

術(shù)后大鼠恢復(fù)2～3 d后進(jìn)行伏核內(nèi)微量注射。注射前，每只后爪分別測量3次HWL和HWT，取平均值作為基礎(chǔ)值，伏核內(nèi)注射15，30，45，60 min后分別測量雙側(cè)HWL和HWT，將給藥后不同時間點(diǎn)的HWL和HWT換算成變化百分率，即：

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對伏核注射位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定注射位點(diǎn)在大鼠伏核組織內(nèi)的數(shù)據(jù)方可納入統(tǒng)計，見圖1。

圖1 伏核定位圖Fig.1 Illustration of the location of the injection needle tips

1.2.4 小針刀療法為了將CCI大鼠隨機(jī)分為3組，針刀治療后分別進(jìn)行伏核內(nèi)注射1 μL：（1）生理鹽水作為對照組（n=7）；（2）1 nmoL的甘丙肽非特異性阻斷劑Galantide（n=6）；（3）2 nmoL的Galantide（n=6）。研究CCI大鼠伏核神經(jīng)細(xì)胞的甘丙肽及其受體是否介導(dǎo)針刀療法對神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用。隨后，為了進(jìn)一步研究GalR2的激活是否介導(dǎo)了針刀干預(yù)神經(jīng)痛的作用，將CCI大鼠隨機(jī)分為2組，針刀治療后分別進(jìn)行伏核內(nèi)注射（1）1 μL乙腈（6%）作為對照組（n=8）；（2）2 nmoL的 GalR2特異性阻斷劑M871（n=8）。

針刀治療時對大鼠進(jìn)行觸診，在其坐骨神經(jīng)結(jié)扎周圍找到條索狀物并用龍膽紫定點(diǎn)，每次選1～2個點(diǎn)，常規(guī)備皮、消毒，用針刀縱向疏通及橫向剝離周圍組織，出針后以消毒棉簽按壓針眼孔片刻后，在腿部肌肉注射 0.2 mL 青霉素鈉（80萬U），以預(yù)防感染。每周治療1次，共3次。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法將CCI大鼠隨機(jī)分為3組：治療組（n=3），CCI大鼠在造模第10天行針刀干預(yù)治療，每周1次，連續(xù)3次；模型組（n=3），僅左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎造模，不進(jìn)行針刀干預(yù)治療；對照組（n=3），CCI大鼠在造模第10天僅針刀插入，不行縱向疏通及橫向剝離。在第3次針刀干預(yù)術(shù)后取各組大鼠雙側(cè)伏核組織，Western blot（WB）法檢測伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2（兔多克隆抗體，1∶2 000，Abcam，英國）的表達(dá)水平，并且以 GAPDH（鼠單克隆抗體，1∶10 000，CST，美國）為內(nèi)參作為對照，用 Image J 軟件分析條帶，表達(dá)結(jié)果重復(fù)3次以上。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計，

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean ± S.E.M.）表示，應(yīng)用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間差異采用雙因素方差分析（Two-way analysis of variance）或單因素方差分析（One-way analysis of variance）進(jìn)行組間比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCI大鼠伏核內(nèi)注射甘丙肽非特異性阻斷劑Galantide對針刀療法鎮(zhèn)痛作用的影響

與“針刀治療+生理鹽水”對照組相比，CCI大鼠伏核內(nèi)注射2 nmoL的Galantide可明顯減弱針刀治療引起的HWL（左側(cè)：P＜ 0.001；右側(cè)：P＜ 0.05）和HWT（左側(cè)：P＜ 0.01；右側(cè)：P＜0.05）的延長，但注射1 nmoL的Galantide差異沒有顯著性（P＞ 0.05）。如圖2所示，組間比較采用雙因素方差分析方法比較。該結(jié)果表明CCI大鼠伏核甘丙肽受體的激活可能介導(dǎo)針刀干預(yù)神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用。

2.2 針刀干預(yù)對CCI大鼠伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2表達(dá)的影響

如圖3所示，與模型組及對照組相比，針刀治療組大鼠伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2的表達(dá)增加（P＜0.01），但比較模型組和對照組GalR2的表達(dá)，差異沒有顯著性（P＞ 0.05）。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示提示針刀治療神經(jīng)痛可能通過激活伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2來介導(dǎo)完成。

圖3 針刀干預(yù)對CCI大鼠伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2表達(dá)的影響Fig.3 Effect of needle knife therapy on GalR2 expression in NAc of CCI rats

2.3 CCI大鼠伏核內(nèi)注射GalR2的特異性阻斷劑M871對針刀鎮(zhèn)痛作用的影響

與“針刀治療+乙腈”對照組相比，CCI大鼠伏核內(nèi)注射2 nmoL的 M871可明顯減弱針刀治療引起的HWL（左側(cè)：P＜ 0.001；右側(cè)：P＜ 0.001）和HWT（左側(cè)：P＜ 0.001；右側(cè)：P＜ 0.01）的延長，如圖4所示，差異采用雙因素方差分析方法比較。該結(jié)果進(jìn)一步表明CCI大鼠伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2的激活介導(dǎo)針刀干預(yù)對神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用。

圖4 CCI大鼠伏核內(nèi)注射M871對針刀鎮(zhèn)痛作用的影響Fig.4 Effects of intra-NAc injection of M871 on the analgesia of needle knife in CCI rats

3 討論

目前臨床治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物副作用明顯，因而大大限制了它們的應(yīng)用。尋找持續(xù)有效且具有臨床應(yīng)用前景的治療手段或藥物，闡明其作用機(jī)制，已成為目前亟待解決的問題。

小針刀療法是中西醫(yī)結(jié)合的一種療法，它既保留了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢，又采用了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，可以起到某些切開手術(shù)和針灸難以單獨(dú)達(dá)到的治療效果。大量的臨床研究資料表明小針刀治療對改善諸如椎管狹窄、椎間盤突出癥、帶狀皰疹后神經(jīng)痛等所致的疼痛癥狀和功能障礙療效顯著[13-19]。但有關(guān)小針刀療法的實(shí)驗(yàn)研究尚處于起步階段，小針刀療法對神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用及其作用機(jī)制尚未得到明確的闡釋。因而限制了其在臨床的推廣和應(yīng)用。研究顯示針刀治療能使第3腰椎橫突綜合征動物模型局部組織中的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而改善局部炎癥反應(yīng)[20]。郭長青等[5]報道針刀治療可促進(jìn)內(nèi)源性阿片肽前體基因的表達(dá)，從而合成和釋放更多的內(nèi)源性阿片肽，參與針刀治療的中樞鎮(zhèn)痛作用。針刀松解法在治療坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠過程中，能促進(jìn)中樞β-內(nèi)啡呔、亮氨酸-腦腓呔釋放[5]。這些研究提示，針刀療法可能通過促進(jìn)內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)的釋放，從而參與鎮(zhèn)痛。

甘丙肽是一種重要的神經(jīng)肽，越來越多的研究表明甘丙肽在痛覺調(diào)制中具有重要作用。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)在正常大鼠、炎癥痛大鼠及CCI大鼠伏核內(nèi)注射甘丙肽具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[7,21-22]。本實(shí)驗(yàn)研究探索針刀療法是否通過促進(jìn)伏核神經(jīng)細(xì)胞甘丙肽的釋放來干預(yù)神經(jīng)痛。

甘丙肽在痛覺調(diào)制中的作用可能和甘丙肽作用于不同的GalR有關(guān)。研究報道與正常大鼠比較，在鹿角菜堿所致炎癥痛大鼠與CCI大鼠，伏核神經(jīng)細(xì)胞甘丙肽、GalR1和GalR2的表達(dá)都上調(diào)[6,7,22-23]，表明伏核神經(jīng)細(xì)胞甘丙肽及其受體在痛覺調(diào)制中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果首先發(fā)現(xiàn)，與“針刀治療+生理鹽水”對照組比較，CCI大鼠針刀治療后伏核內(nèi)注射GalRs的共同阻斷劑Galantide（“針刀治療+Galantide”）明顯減弱針刀對CCI大鼠的鎮(zhèn)痛作用，且呈劑量依賴性（圖2）。先前的研究報道在CCI大鼠伏核內(nèi)注射GalR2的特異性激動劑M1145具有鎮(zhèn)痛作用，而注射M1145后再注射GalR2的特異性拮抗劑M871則能逆轉(zhuǎn)M1145引起的鎮(zhèn)痛作用，表明伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2的激活對CCI大鼠具有鎮(zhèn)痛作用[23]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)CCI大鼠行針刀治療后伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2的表達(dá)增加（圖3），并且在對CCI大鼠行針刀干預(yù)治療后，于伏核內(nèi)注射M871（針刀治療+M871）阻斷GalR2的激活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與“針刀治療+乙腈”對照組比較，針刀治療后伏核內(nèi)注射M871削弱了針刀對CCI大鼠的鎮(zhèn)痛作用（圖4），這些結(jié)果提示伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2的激活在針刀干預(yù)神經(jīng)痛中具有重要作用。

綜上所述，CCI大鼠伏核內(nèi)注射Galantide阻斷甘丙肽受體后能削弱針刀治療神經(jīng)痛的作用；且針刀治療引起CCI大鼠伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR2的表達(dá)上調(diào)，CCI大鼠伏核內(nèi)注射GalR2的特異性阻斷劑M817明顯減弱了針刀療法對神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用，這些研究都提示在CCI大鼠，針刀干預(yù)可能通過促進(jìn)伏核神經(jīng)細(xì)胞甘丙肽的釋放，進(jìn)而激活GalR2介導(dǎo)來針刀對神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用，但有關(guān)GalRs的激活介導(dǎo)針刀對神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。