擴張型心肌病(DCM)患者主要以心腔擴大、心肌收縮功能減退為特征，臨床常表現(xiàn)為進行性心力衰竭[1-2]。心肌細胞是心臟收縮和舒張的基本結(jié)構(gòu)單元，由細胞膜結(jié)構(gòu)、肌纖維、細胞核、線粒體等多種細胞器構(gòu)成。多種原因?qū)е滦募≈貥?gòu)時，這些亞細胞器會出現(xiàn)一系列改變，使細胞出現(xiàn)功能紊亂[3]。了解心肌細胞亞細胞器的超微結(jié)構(gòu)變化與細胞功能的關(guān)系及其在DCM發(fā)生、發(fā)展中的作用，對DCM的早期診斷和治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

60只3周齡SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(50±5)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證號為11400700277616，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)細胞成像實驗室動物中心，實驗動物使用許可證號為SYXK(豫)2016-0009。本實驗遵守國家有關(guān)實驗動物保護和實驗準(zhǔn)則。

1.2 實驗分組與模型制備

按隨機編號方法在Wistar大鼠尾部標(biāo)號，分為正常組(n=10)和DCM組(n=50)。正常組不進行干預(yù)，給予基礎(chǔ)飲食；DCM組每日給予70%呋喃唑酮溶液誘導(dǎo)DCM模型，連續(xù)給藥10周后進行超聲心動儀檢測。

1.3 超聲心動圖檢測

采用小動物超聲心動儀，將超聲探頭放在大鼠乳頭肌水平處，獲取大鼠胸骨左室長軸切面視野圖，M超測量線放在乳頭肌后緣，切換M超視野，測量和計算左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室縮短分數(shù)(LVFS)、左室射血分數(shù)(LVEF)。1位專業(yè)超聲人員對所有大鼠進行檢測，測量3個心動周期，每個指標(biāo)取平均值。

1.4 透射電子顯微鏡觀察亞細胞器超微結(jié)構(gòu)

取出心臟，迅速剪取左心室心尖部位小塊心肌組織，切成3～4個1 mm×1 mm×1 mm的組織標(biāo)本，立即放入2.5%戊二醛固定液，固定4 h，換液，1%鋨酸固定2 h，磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.2)沖洗3次，15 min/次，用梯度濃度30%、50%、70%、80%、90%、100%的酒精脫水，15 min/次，常規(guī)樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊時兩組間比較采用LSD法檢驗，方差不齊時兩組間比較采用Tamhane′s法檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組心臟超聲結(jié)果比較

采用高分辨率的小動物超聲探頭測定各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化。與正常組比較，DCM組的LVESD和LVEDD明顯增加，LVFS和LVEF顯著降低(P均<0.05)，見圖1、表1。

圖1 正常組和DCM組超聲心動圖結(jié)果

表1 兩組大鼠超聲心動圖檢測結(jié)果比較

2.2 正常組心肌細胞亞細胞器超微結(jié)構(gòu)

正常組心肌細胞肌絲排列整齊，線粒體呈線狀排列在肌絲束間，肌小節(jié)及其Z線清楚可見；閏盤彎曲走行，其近旁的肌漿有糖原顆粒及少量囊泡存在，嵌于閏盤網(wǎng)的肌絲清晰可見；肌原纖維呈規(guī)則的帶狀結(jié)構(gòu)；核染質(zhì)顆粒分布較均勻，脂滴適量，溶酶體小且少見，見圖2。

圖2 正常心肌細胞超微結(jié)構(gòu)(×12 000)

2.3 DCM組心肌細胞核結(jié)構(gòu)變化

DCM組心肌細胞核增大且較長，核周間隙明顯增寬。見圖3。

注：DCM大鼠心肌細胞核增大；紅色箭頭所指為核周間隙圖3 DCM大鼠心肌細胞核超微結(jié)構(gòu)(×12 000)

2.4 DCM組心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)變化

DCM組心肌細胞線粒體數(shù)量異常增多，聚集成簇，線粒體基質(zhì)內(nèi)有鈣鹽樣致密顆粒沉積；線粒體出現(xiàn)高度腫脹、嵴斷裂或消失、空泡化。見圖4。

注：A示心肌細胞線粒體數(shù)量增多，聚集成簇，紅色箭頭所指為線粒體基質(zhì)內(nèi)鈣鹽樣致密顆粒沉積；B示線粒體形態(tài)變化，M為線粒體圖4 DCM大鼠心肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)(×12 000)

2.5 DCM組心肌細胞閏盤結(jié)構(gòu)變化

DCM組閏盤的中間連接及橋粒結(jié)構(gòu)模糊，間隙增寬，亦可見線粒體腫脹、空泡化。見圖5。

注：紅色箭頭所指為閏盤中間連接；M為線粒體；ID為閏盤圖5 DCM大鼠心肌細胞閏盤超微結(jié)構(gòu)(×12 000)

2.6 DCM組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體結(jié)構(gòu)變化

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)由片狀和管狀兩種結(jié)構(gòu)連接組成，如圖6所示。DCM組片狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要分布在細胞核周區(qū)域，向內(nèi)與外核膜相連；管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則通常連接形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。DCM組細胞中溶酶體異常增大，且附近有散在糖原顆粒。

2.7 DCM組橫管和肌質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)變化

DCM組心肌細胞膜深入肌細胞內(nèi)形成的橫管，橫靠心肌纖維Z線，與心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)分支互相吻合，網(wǎng)孔明顯增大。DCM組橫管結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，肌原纖維和線粒體亦出現(xiàn)紊亂。見圖7。

注：A為×12 000；B為×36 000，B是圖A中紅框放大所示，紅色箭頭所指為溶酶體，RER為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)圖6 DCM大鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體超微結(jié)構(gòu)

注:A為×30 000；B為×90 000，是圖A中紅框放大所示，SR為肌質(zhì)網(wǎng)，TT為橫管圖7 DCM大鼠心肌細胞橫管和肌質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)

3 討論

對充血性心力衰竭不同動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)各種亞細胞器損傷及細胞器之間的聯(lián)系失衡可引起細胞損傷，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能失代償，引發(fā)心力衰竭[4]。

線粒體是心肌細胞內(nèi)的產(chǎn)能細胞器。心肌肥大時，先出現(xiàn)線粒體肥大，它的改變早于肌原纖維的肥大[5-6]。隨著疾病進一步發(fā)展，線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡化，進而出現(xiàn)功能障礙，引起細胞能量代謝紊亂，最終導(dǎo)致DCM的發(fā)生。本研究觀察到DCM大鼠心肌細胞線粒體增生，數(shù)量異常增多，聚集成簇，線粒體出現(xiàn)腫脹變形、嵴斷裂消失及空泡化現(xiàn)象。線粒體的結(jié)構(gòu)損傷使膜通透性增大，導(dǎo)致線粒體膜功能障礙。閏盤主要由橋粒、中間連接和縫隙連接組成，其在心肌細胞的電、機械和代謝耦聯(lián)中發(fā)揮重要作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)DCM大鼠閏盤的中間連接及橋粒結(jié)構(gòu)模糊。閏盤中間連接增寬，可使心肌細胞收縮減弱，破壞細胞間的機械-電耦合，促使心肌間質(zhì)纖維化發(fā)生，導(dǎo)致DCM。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的發(fā)生常早于基因轉(zhuǎn)錄水平的細胞核反應(yīng)和代謝水平的線粒體反應(yīng)，持續(xù)而嚴重的ERS可觸發(fā)細胞凋亡，造成細胞損傷[8-9]，引起DCM。溶酶體作為一種膜包裹的囊狀細胞器，通過自噬降解受損的細胞器，調(diào)節(jié)底物供應(yīng)以維持心肌能量，從而維持正常的心臟功能和心肌細胞穩(wěn)態(tài)[10-11]。研究表明，心肌細胞橫管重構(gòu)在心肌肥大代償期即已發(fā)生[12-13]。本研究觀察到DCM大鼠橫管結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，溶酶體異常增大，肌原纖維出現(xiàn)排列紊亂，隨著DCM發(fā)展，溶酶體和橫管結(jié)構(gòu)紊亂加重。

心肌細胞及其亞細胞器超微結(jié)構(gòu)的改變早于心臟收縮功能障礙，深入了解心肌細胞超微結(jié)構(gòu)變化和影響心肌細胞亞細胞器穩(wěn)態(tài)的相關(guān)調(diào)控蛋白作用，可為DCM臨床診治提供新思路。