羅珍珍 張存旭 朱景樂 王 敏 張艷婷

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003）

栓皮櫟（Quercus variabilis）屬于殼斗科（Fagaceae）櫟屬，是我國特有的落葉喬木，廣泛分布于華北、華南、西南地區(qū)。除了能進(jìn)行木材、薪材、食用菌、天麻、橡子、栲膠生產(chǎn)外，樹皮木栓層剝?nèi)『筮€可制軟木，是我國最主要的軟木資源樹種，具有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟(jì)價值[1]。近年來，由于栓皮櫟林受到環(huán)境影響、人為破壞以及病蟲危害導(dǎo)致生產(chǎn)力下降。林木遺傳改良是提高生產(chǎn)力和抗病蟲害能力的重要途徑，然而栓皮櫟種子繁殖周期長，常規(guī)無性繁殖生根困難，這已成為該樹種遺傳改良的限制因子。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，人們已將植物基因工程和常規(guī)育種相結(jié)合，以便加快遺傳改良的進(jìn)程。其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是植物轉(zhuǎn)基因強(qiáng)有力的生物技術(shù)工具。以植物器官發(fā)生作為轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，國內(nèi)外已先后在藍(lán)桉（Eucalyptus globulus）[2]、楊樹（Populus alba×P. berolinensis和Populus davidiana×P. bolleana）[3]、馬尾松（Pinus massoniana）[4]等樹種上得到轉(zhuǎn)化植株。用體胚發(fā)生作為轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)在輻射松（Pinus radiate）[5]、扁柏（Chamaecyparis obtusa）[6]、核桃（Juglans hindsii‘Rawlins’×Juglans regia）[7]等樹種實現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化。

GUS基因（β-glucuronidase）和hptII基因（hygromycin phosphotransferase II gene）是遺傳轉(zhuǎn)化中常用到的報告基因和標(biāo)記基因。GUS基因編碼β-葡糖醛酸酶，β-葡糖醛酸酶作用于X-Gluc的產(chǎn)物經(jīng)過氧化形成不溶解的藍(lán)色物質(zhì)，使具有GUS活性的部位呈現(xiàn)藍(lán)色，常依據(jù)此原理檢測目的基因的轉(zhuǎn)入[8]。hptII基因編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞后可賦予對潮霉素的抗性，用于抗性組織的篩選[9]。

在櫟類樹種中，Vidal等以Quercus robur的葉片誘導(dǎo)的體胚作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化受體，成功實現(xiàn)植株再生[10]。álvarez等建立了成齡歐洲栓皮櫟（Quercus suber）的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，獲得了43%的轉(zhuǎn)化率[11]。而栓皮櫟的遺傳轉(zhuǎn)化研究較少。本研究以栓皮櫟體細(xì)胞胚胎發(fā)生為受體系統(tǒng)，研究影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，為利用基因工程對栓皮櫟進(jìn)行遺傳改良建立一個可靠、可重復(fù)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)的單株栓皮櫟，采集授粉后7～8周的堅果，剝?nèi)∥闯墒旌献优撸谔砑恿?.4 mg/L 6-BA和0.4 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚發(fā)生，以其中一個胚性細(xì)胞系用于遺傳轉(zhuǎn)化研究。胚性組織通過次生體胚發(fā)生的方式在增殖培養(yǎng)基上保持與增殖，每4周繼代1次。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基[12]，均添加3%蔗糖和0.6%瓊脂。其中，增殖培養(yǎng)基添加0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D；預(yù)培養(yǎng)基添加1.0mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+200 mg/L水 解 酪蛋白+400 mg/L谷氨酰胺；共培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+200 mg/L水 解 酪 蛋 白+400 mg/L谷氨酰胺+乙酰丁香酮（AS）；選擇培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+200 mg/L水解酪蛋白+400 mg/L谷氨酰胺+30 mg/L潮霉素（Hyg）+300 mg/L頭孢霉素（Cef）。pH值調(diào)到5.8后在121 ℃高壓滅菌30 min。培養(yǎng)條件為(25±2) ℃，暗培養(yǎng)。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化

1.3.1 菌株與載體

農(nóng)桿菌菌株為EHA105，轉(zhuǎn)化載體為pCAMBIA1301，該質(zhì)粒載體攜帶有潮霉素抗性基因hptⅡ和GUS報告基因[8]。菌株與載體由西北農(nóng)林科技大學(xué)彭少兵教授提供。

1.3.2 農(nóng)桿菌的活化

挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種于含有50 mg/L卡那霉素、20 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下200 r/min搖菌24 h。之后于3 000 r/min離心沉淀，再將沉淀重懸于MS基本培養(yǎng)基中至所需的OD600備用。

1.3.3 抗生素敏感性試驗

將胚性組織分別接種到含有不同濃度潮霉素、頭孢霉素的預(yù)培養(yǎng)基上。潮霉素濃度設(shè)定為4、15、30、50 mg/L，頭孢霉素濃度設(shè)定為100、150、200、250、300 mg/L。

1.3.4 轉(zhuǎn)化試驗

分離2～3個球形或心形/魚雷期的體胚小團(tuán)塊，在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5、10、15 d，置于OD600=0.25、0.5、0.8的菌液中侵染10、20、30 min，取出并用無菌濾紙吸去表面多余的菌液，后接入共培養(yǎng)基（添加50、100、200 μmol/L乙酰丁香酮）中培養(yǎng)1、3、5 d，再轉(zhuǎn)接到選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。進(jìn)行其中的某個因素試驗時，其他因素設(shè)定為：不經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)，OD600=0.5，侵染時間為20 min，共培養(yǎng)天數(shù)為3 d，AS濃度為100 μmol/L。此后，新生的次生胚在選擇培養(yǎng)基上每2周繼代1次進(jìn)行胚性組織的增殖培養(yǎng)。

1.3.5 GUS組織化學(xué)染色

將經(jīng)過4周選擇培養(yǎng)后產(chǎn)生的次生胚團(tuán)塊浸入改良的Jefferson GUS反應(yīng)緩沖液[13]，緩沖液組成為50 mmol/L Na2HPO4+NaH2PO4，pH值 7.0；2 mmol/L K3[Fe(CN)6]；2 mmol/L K4[Fe(CN)6·3H2O]；10 mmol/L Na2EDTA，pH值 8.0；0.1%Triton X-100；2 mmol/L X-Gluc。在37 ℃保溫24 h后，用體視顯微鏡（OLYMPUS SZX16）觀察。

1.3.6DNA的提取和GUS基因的PCR檢測

采用植物基因組DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)CW0553S），從胚性組織中提取DNA作為模板。GUS基因的上游引物為5′-TACCGACGA AAACGGCAAGA-3′，下游引物為5′-GCTAAC GTATCCACGCCGTA-3′。擴(kuò)增體系組成：2 μL模板，1 μL上游引物，1 μL下游引物，10 μL 2×TaqPCR Pre Mix，6 μL dd H2O。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；62 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min；4 ℃終止；4 ℃保存，30個循環(huán)。每個PCR產(chǎn)物（1 μL）與1 μL上樣液染料混合上樣，采用1×TAE緩沖液制成的2%瓊脂糖凝膠電泳分離，核酸染料染色，用凝膠成像儀（君意電泳JY04S-3E）檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。

1.4 數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計分析

試驗均為單因素試驗，設(shè)計每一處理20個外植體為1次重復(fù)，共重復(fù)3次。培養(yǎng)4周后統(tǒng)計體胚成活率和GUS轉(zhuǎn)化率。成活率為成活的體胚團(tuán)塊數(shù)量占每個處理接種團(tuán)塊總數(shù)的百分比，GUS轉(zhuǎn)化率為GUS染色呈藍(lán)色的體胚團(tuán)塊數(shù)量占每個處理成活團(tuán)塊數(shù)的百分比。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，其中包括方差分析和最小顯著差數(shù)（LSD）測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對胚性愈傷組織成活的影響

潮霉素對胚性組織成活的影響如圖1所示，當(dāng)培養(yǎng)基中潮霉素的濃度為4 mg/L時，對胚性組織幾乎沒有影響，成活率為98.3%，與0 mg/L濃度下的成活率相比并沒有顯著差異；當(dāng)培養(yǎng)基中潮霉素濃度為15 mg/L時，成活率下降為53.3%，與0 mg/L濃度下的成活率有顯著差異；濃度達(dá)到30 mg/L時，組織體積變小，與培養(yǎng)基相接觸一側(cè)的組織很快褐化，長勢逐漸變差，并且沒有再長出次生胚，1個月后這些組織完全變黑，最終死亡，30 mg/L潮霉素導(dǎo)致組織成活率非常低，僅為1.7%；當(dāng)潮霉素濃度為50 mg/L時，胚性組織全部變黑死亡，無次生胚產(chǎn)生。30 mg/L和50 mg/L濃度下的成活率與其他濃度下的成活率有顯著差異，但這二者之間沒有顯著差異，綜合考慮，把30 mg/L 潮霉素作為栓皮櫟胚性組織的篩選壓。

圖1 潮霉素對胚性組織的影響Fig. 1 Effect of hygromycin on embryogenesis cluster

胚性組織在含不同濃度頭孢霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后，成活率各有不同。圖2可以看出，添加100 mg/L的頭孢霉素對胚性組織成活率的影響并不明顯；當(dāng)頭孢霉素濃度達(dá)到150 mg/L時，胚性組織長勢變差，成活率為63.3%，與100 mg/L濃度下的成活率相比有顯著差異，而與200 mg/L濃度下的成活率相比并沒有顯著差異；另外在250 mg/L的情況下，大部分組織逐漸發(fā)黑、褐化，33.3%的組織仍存活并有次生胚產(chǎn)生；當(dāng)培養(yǎng)基中添加的頭孢霉素濃度為300 mg/L時，胚性組織絕大多數(shù)變黑死亡，僅有5%成活，與其他濃度下的成活率相比均有顯著差異。因此，可將300 mg/L頭孢霉素也作為栓皮櫟胚性組織的篩選壓。

圖2 頭孢霉素對胚性組織的影響Fig. 2 Effect of cefotaxime on embryogenesis cluster

2.2 預(yù)培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

由表1可以看出，適當(dāng)時間的預(yù)培養(yǎng)可提高體胚成活率與GUS轉(zhuǎn)化率。隨著預(yù)培養(yǎng)時間的延長，成活率逐漸升高，預(yù)培養(yǎng)15 d的成活率最高。對于GUS轉(zhuǎn)化率，預(yù)培養(yǎng)15 d的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到91.7%，與預(yù)培養(yǎng)5 d和10 d的效果相比差異顯著，因此15 d為適宜的預(yù)培養(yǎng)時間。

表1 預(yù)培養(yǎng)天數(shù)對遺傳轉(zhuǎn)化的影響Table 1 Effect of pre-cultivation days on genetic transformation

2.3 菌液濃度和侵染時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

隨著菌液濃度的升高，體胚成活率與GUS轉(zhuǎn)化率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。由表2可知，菌液濃度OD600為0.25時，GUS轉(zhuǎn)化率較低；OD600=0.5時，體胚成活率升高，GUS轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%；OD600為0.8時由于農(nóng)桿菌污染嚴(yán)重難以脫菌，造成體胚成活率極低，僅為1.7%，而后導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率為0。綜合考慮，侵染栓皮櫟體胚的適宜農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0.5。

表2 菌液濃度對遺傳轉(zhuǎn)化的影響Table 2 Effect of Agrobacterium concentration on genetic transformation

侵染時間延長，體胚成活率與GUS轉(zhuǎn)化率先升高后降低。由表3可知，農(nóng)桿菌侵染體胚時，侵染10 min農(nóng)桿菌不能有效地在傷口處吸附，共培養(yǎng)后農(nóng)桿菌生長較少，在后續(xù)培養(yǎng)中體胚的轉(zhuǎn)化率低；侵染20 min時，體胚成活率與GUS轉(zhuǎn)化率最高，分別達(dá)到11.7%和82.9%；當(dāng)侵染30 min時，農(nóng)桿菌對體胚的毒害作用較大，造成體胚成活率與轉(zhuǎn)化率低。各侵染時間的GUS轉(zhuǎn)化率無顯著差異，考慮到侵染20 min時的體胚成活率最高，因此將20 min作為適宜的侵染時間。

表3 侵染時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響Table 3 Effect of infection time on genetic transformation

2.4 共培養(yǎng)時間和乙酰丁香酮對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

侵染之后進(jìn)入共培養(yǎng)階段。由表4可知，體胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)1 d的成活率和轉(zhuǎn)化率最低。共培養(yǎng)時間為3 d時，成活率最高，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%；共培養(yǎng)5 d時，由于受體材料與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時間過長，農(nóng)桿菌過度生長而對體胚產(chǎn)生毒害，造成后續(xù)培養(yǎng)脫菌困難，成活率和轉(zhuǎn)化率都有所降低。雖然各個共培養(yǎng)時間的GUS轉(zhuǎn)化率無顯著差異，考慮到共培養(yǎng)3 d的成活率與轉(zhuǎn)化率最高，因此適宜的共培養(yǎng)時間為3 d。

表4 共培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響Table 4 Effect of co-cultivation time on genetic transformation

乙酰丁香酮對Vir區(qū)基因的活化具有重要作用，在共培養(yǎng)基中加入適量乙酰丁香酮有利于轉(zhuǎn)化。表5可知，當(dāng)乙酰丁香酮濃度為50 μmol/L時的成活率和GUS轉(zhuǎn)化率最低，隨著乙酰丁香酮濃度的升高，體胚成活率與GUS轉(zhuǎn)化率也逐漸升高，200 μmol/L時的成活率和GUS轉(zhuǎn)化率最高，分別為15.0%和100.0%。因此，在共培養(yǎng)基中添加200 μmol/L的乙酰丁香酮最為適宜。

表5 共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮濃度對遺傳轉(zhuǎn)化的影響Table 5 Effect of concentration of AS added to co-culture medium on genetic transformation

2.5 GUS染色和PCR檢測

GUS組織活性檢測結(jié)果表明，經(jīng)過GUS組織化學(xué)染色，轉(zhuǎn)化的胚性組織呈藍(lán)色（圖3d）。本研究中，使用GUS基因表達(dá)的結(jié)果確定轉(zhuǎn)化條件，最終得到了轉(zhuǎn)GUS基因組織，目前，導(dǎo)入GUS基因的胚性組織正在進(jìn)行體胚成熟培養(yǎng)，然后再進(jìn)行植株再生培養(yǎng)。在經(jīng)過GUS染色驗證的轉(zhuǎn)化胚性組織中選取12塊組織作GUS基因檢測，同時，以未轉(zhuǎn)化組織為陰性對照，質(zhì)粒DNA為陽性對照。陽性質(zhì)粒對照和1、2、3、5、6、7、8、10、11、12號轉(zhuǎn)化胚性組織均能擴(kuò)增出1 086 bp的目標(biāo)條帶，進(jìn)一步證明GUS基因已轉(zhuǎn)入到體胚中。而未轉(zhuǎn)化對照組織和4、9號組織不能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶（圖4），初步確定4和9為假陽性組織，其他為陽性組織。

圖3 遺傳轉(zhuǎn)化外植體及瞬時GUS表達(dá)Fig. 3 Explants used for genetic transformation and transient GUS expression in somatic embryos

圖4 轉(zhuǎn)化體胚的PCR分析Fig. 4 PCR analysis of transformed embryos

3 結(jié)論與討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化過程中一般經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、抗性篩選培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因再生等多個環(huán)節(jié)[14]。共培養(yǎng)結(jié)束后，需要用抗生素抑制農(nóng)桿菌的生長，并利用抗性篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，根據(jù)所用質(zhì)粒的不同，選用的抗生素也不同。在前人的研究中多采用卡那霉素和潮霉素作為選擇抗生素，頭孢霉素作為抑菌抗生素[15-16]，而不同植物對各種抗生素的耐受力也各不相同。在Sánchez等[17]測試的所有卡那霉素濃度下，組織塊均可以存活，表明卡那霉素不足以作為篩選轉(zhuǎn)化組織的抗生素，而潮霉素和頭孢霉素的濃度分別為50 mg/L和300 mg/L是選擇抗生素的適宜劑量。本研究中，在選擇培養(yǎng)階段潮霉素和頭孢霉素的適宜濃度分別為30 mg/L和300 mg/L，由于樹種的不同導(dǎo)致所用潮霉素劑量不同。

一般而言，植物材料先經(jīng)過一段時間的預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行浸染，既可以減少農(nóng)桿菌的損傷又能促進(jìn)細(xì)胞處于最佳分裂狀態(tài)，提高轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)和穩(wěn)定整合率，但不同植物對農(nóng)桿菌的敏感度不同[18]，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過15 d預(yù)培養(yǎng)的栓皮櫟體胚轉(zhuǎn)化率最高，而張曉英等[19]將國槐（Styphnolobium japonicum）葉片預(yù)培養(yǎng)5 d達(dá)到最佳效果。菌液濃度過高、侵染時間過長，農(nóng)桿菌會對組織產(chǎn)生較大傷害，菌液濃度過低、侵染時間過短，則減少了T-DNA的整合概率而使轉(zhuǎn)化率降低[20]；本研究發(fā)現(xiàn)菌液濃度為OD600=0.5侵染20 min時，轉(zhuǎn)化率最高，此結(jié)果與álvarez等[11]的結(jié)果基本一致。

農(nóng)桿菌附著在組織上不能立即轉(zhuǎn)化，只有經(jīng)過適當(dāng)?shù)墓才囵B(yǎng)才能完成基因向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而整合到植物基因組。本研究將攜帶農(nóng)桿菌的胚性組織共培養(yǎng)3 d轉(zhuǎn)化率可達(dá)到100%，但是組織的染色呈現(xiàn)出局部藍(lán)色或藍(lán)色較淺，在所用的共培養(yǎng)基中加入200 μmol/L乙酰丁香酮后得到的組織染出了整體均勻的深藍(lán)色，達(dá)到GUS表達(dá)的最佳效果，王蓓蓓等[21]也發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3 d、添加200 μmol/L乙酰丁香酮對雜種白楊353（Populus tremula×Populus tremu-loides）的葉盤分化率有提高；而賈小明等[16]卻發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)基中添加AS對河北楊（Populus hopeiensis）葉片轉(zhuǎn)化率沒有明顯影響，分析其原因，AS的效果可能與菌株類型、植物種類和共培養(yǎng)基的pH值有關(guān)，AS與其他因素的交互作用還有待進(jìn)一步研究。乙酰丁香酮作為一種誘導(dǎo)性較好的酚類化合物，主要是用來誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的活化與表達(dá)，促進(jìn)T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移[22]。目前，在大多數(shù)的研究中，無論是侵染液還是共培養(yǎng)基，乙酰丁香酮的有效使用濃度一般在50～200 μmol/L。

GUS是被廣泛使用的報告基因系統(tǒng)之一。杜麗等[14]通過對胚性愈傷組織GUS染色呈現(xiàn)出的藍(lán)色確定了GUS基因的導(dǎo)入。林義章等[23]根據(jù)GUS基因設(shè)計引物對再生植株進(jìn)行PCR檢測，證實GUS基因已成功轉(zhuǎn)入到植株基因組中。本研究通過GUS染色和PCR檢測，證實了GUS基因的轉(zhuǎn)入。

總之，本研究分析了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的栓皮櫟遺傳轉(zhuǎn)化的不同因素。其中，預(yù)培養(yǎng)時間、菌液濃度和乙酰丁香酮濃度這3個因素是影響轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵。通過本試驗得到了栓皮櫟的陽性體胚，將進(jìn)一步進(jìn)行植株再生。初步建立了以栓皮櫟體胚發(fā)生為受體的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為進(jìn)一步建立高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ)。