柳成東，肖明霞，李琦華，程志斌

（云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南昆明 650201）

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（第194 號公告）定于2020 年7月1 日起全面禁止促生長藥物飼料添加劑的使用，包括飼用益生菌等諸多替抗類產(chǎn)品的篩選及應(yīng)用成為重要研究方向[1]。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是分泌乳酸的芽孢桿菌屬益生菌，近年來成為研究熱點[2]。已有動物飼養(yǎng)試驗顯示，飼糧中添加單一凝結(jié)芽孢桿菌能通過抑制大腸桿菌、沙門氏菌等腸道主要有害菌，顯著改善畜禽生長性能[3-5]；也有報道稱，凝結(jié)芽孢桿菌與其他飼用益生菌組合的飼喂效果低于單一凝結(jié)芽孢桿菌[3,6]。由此可見，飼用益生菌等添加劑替抗的動物飼養(yǎng)試驗易受試驗動物、試驗場地、試驗條件等因素的影響，試驗結(jié)果重復(fù)性不穩(wěn)定[7-8]，且動物飼養(yǎng)試驗的周期較長、費用高。因此，針對凝結(jié)芽孢桿菌等替抗產(chǎn)品性能的初步篩選，建立科學、高效的體外實驗室評估方法，有助于提高動物飼養(yǎng)試驗的研發(fā)效率和可重復(fù)性[7-8]。

牛津杯法已用于凝結(jié)芽孢桿菌的體外抑菌性能評估[9-15]，然而現(xiàn)有的報道存在2 個問題：其一，凝結(jié)芽孢桿菌抑菌作用的研究不系統(tǒng)。目前，凝結(jié)芽孢桿菌對腸道有害菌[12-15]及飼料源有害菌[9,12]抑制作用的研究較多，對多種商業(yè)飼用益生菌的抑制研究報道較少[9-10,12]，且對乳酸桿菌等腸道有益菌的抑制研究沒有報道；其二，凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌效果不明確。已報道的凝結(jié)芽孢桿菌牛津杯法抑菌試驗均沒有設(shè)計抗生素對照組，這不利于比較確定凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌效果。據(jù)此，本研究以廣譜抗菌藥物飼料添加劑金霉素和土霉素為參照，采用牛津杯法較為系統(tǒng)地評估凝結(jié)芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌、腸道有益菌、飼料源有害菌、商業(yè)飼用益生菌等的抑菌作用及效果，為其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

試驗中11 個指示菌包括4 類。腸道有害菌：大腸桿菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、大腸桿菌K99（Escherichia coliBNCC125787）、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuisBNCC186354）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）；腸道有益菌：羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）；飼料源有害菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusBNCC186335）；商業(yè)飼用益生菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisATCC PTA-6737）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisbio-58806）、屎腸球菌（Enterococcus faeciumbio-67122）、糞腸球菌（Enterococcus faecalisBNCC192631）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utiliBNCC336517）。以上菌株購買自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司和北京百歐博偉生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計 設(shè)金霉素組、土霉素組、凝結(jié)芽孢桿菌組3 個處理組，采用牛津杯法對比評估凝結(jié)芽孢桿菌對以上4 類11 個指示菌的抑制效果。

1.3 牛津杯抑菌試驗步驟及抑菌作用判定

1.3.1 凝結(jié)芽孢桿菌及指示菌的培養(yǎng) 凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)參考課題組前期報道[16]；指示菌大腸桿菌K88 和K99、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等采用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)；指示菌羅伊氏乳酸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母等采用MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.2 指示菌涂布平板制備 將涂布平板所用的MRS 固體培養(yǎng)基在121℃滅菌30 min，冷卻至45℃后倒入無菌培養(yǎng)皿[14]。凝固后，待水分干燥，即可涂布。

1.3.3 指示菌液稀釋涂布 ①將培養(yǎng)24 h 的大腸桿菌K88 和K99、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的菌液吸取800 μL，轉(zhuǎn)入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管，進行梯度稀釋至10-5涂布。每次操作，每個指示菌涂3 個培養(yǎng)皿（3 次平行測定）。②將培養(yǎng)24 h 的伊氏乳酸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌液吸取800 μL，轉(zhuǎn)入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管，進行梯度稀釋至10-3涂布。每次操作，每個指示菌涂3 個培養(yǎng)皿（3 次平行測定）。

1.3.4 牛津杯抑菌測定 為統(tǒng)計比較3 個處理組（金霉素，I 組；土霉素，II 組；凝結(jié)芽孢桿，III 組）對某一個指示菌的抑制效果，每個指示菌吸取200 μL 涂布1個培養(yǎng)皿，并在每個培養(yǎng)皿中放置3 個牛津杯，分別用于加入100 μL 的金霉素、土霉素、凝結(jié)芽孢桿菌菌液。然后，37℃恒溫培養(yǎng)24 h[14]，之后測定抑菌圈直徑（Diameter of Inhibition Zone，DIZ）。以抑菌圈直徑最大值和最小值的平均值確定抑菌圈直徑，并用于抑菌作用判定和抑菌效果比較分析。

1.3.5 抑菌作用判定方法 凝結(jié)芽孢桿菌抑菌作用判定目前尚無統(tǒng)一標準，本研究參考李靜舒等[15]報道，并依據(jù)所用牛津杯的直徑值（7.8 mm），將牛津杯外徑的約2 倍16.0 mm 區(qū)分為“敏感”與“高敏感”，因此判定設(shè)定標準：“不敏感”，DIZ=7.8 mm；“敏感”，7.8 mm＜DIZ ≤16.0 mm；“高敏感”，DIZ＞16.0 mm。

4.應(yīng)有落地問題上的挑戰(zhàn)。工信部信息中心此前發(fā)布的《2018年中國區(qū)塊鏈產(chǎn)業(yè)白皮書》顯示，截至2018年3月底，我國以區(qū)塊鏈為主營業(yè)務(wù)的區(qū)塊鏈公司數(shù)量已超過450家，中國區(qū)塊鏈產(chǎn)業(yè)初步形成規(guī)模。但這其中大部分的項目無法落地。

1.4 統(tǒng)計分析 對處理組之間的抑菌圈直徑數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和LSD 多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，分析采用SAS9.4 統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌對腸道主要有害菌的抑制作用 表1和圖1 可知，凝結(jié)芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用達到“高敏感”（DIZ=19.8 mm）；相反，金霉素和土霉素對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用判定為“不敏感”（DIZ=7.8 mm）。凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K99 的抑制作用達到“敏感”（7.8 mm＜DIZ ≤16.0 mm），且與金霉素、土霉素的抑菌作用差異不顯著（P＞0.05）。凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88 和雞白痢沙門氏菌的抑制作用也達到“敏感”（7.8 mm＜DIZ ≤16.0 mm），然而其抑制作用小于（P＜0.05）金霉素和土霉素。由此可見，4 個腸道主要有害菌中，凝結(jié)芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制效果最顯著。

表1 凝結(jié)芽孢桿菌與金霉素、土霉素對畜禽腸道主要有害菌的抑制作用 mm

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌對腸道主要有害菌的抑制效果

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌對腸道主要有益菌乳酸桿菌的抑制作用 由圖2 可知，凝結(jié)芽孢桿菌對畜禽腸道主要有益菌乳酸桿菌（羅伊氏乳酸桿菌）抑菌作用，判定為“不敏感”（DIZ=7.8 mm）；相反，金霉素、土霉素對羅伊氏乳酸桿菌的抑菌圈直徑分別為24.3 mm、24.1 mm，判定為“高敏感”。

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌與金霉素、土霉素對畜禽腸道主要有益菌羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌對飼料源有害菌金黃色葡萄球菌的抑制作用 由圖3 可知，凝結(jié)芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為14.7 mm，判定為“敏感”；且抑制效果小于金霉素（DIZ=28.6 mm，高敏感）和土霉素（DIZ=28.4 mm，高敏感）（P＜0.001）。

圖3 凝結(jié)芽孢桿菌與金霉素、土霉素對飼料源有害菌金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌對主要商業(yè)飼用益生菌的抑制作用由表2 和圖4 可知，凝結(jié)芽孢桿菌對糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母的抑制作用，判定為“不敏感”。凝結(jié)芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌的抑制作用達到“敏感”（DIZ=11.3 mm），且抑制作用小于金霉素（DIZ=14.0 mm）（P＜0.001），但大于土霉素（DIZ=9.6 mm）（P＜0.001）。凝結(jié)芽孢桿菌對地衣芽孢桿菌、屎腸球菌的抑制作用也達到“敏感”，且抑制作用小于金霉素和土霉素（P＜0.001）。

圖4 凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)飼用益生菌的抑制效果

表2 凝結(jié)芽孢桿菌與金霉素、土霉素對主要商業(yè)飼用益生菌的抑制作用 mm

3 討 論

3.1 凝結(jié)芽孢桿菌對腸道主要有害菌的抑制作用 豬霍亂沙門氏菌感染易引發(fā)仔豬副傷寒，是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見的腸道傳染病之一，導(dǎo)致仔豬嚴重下痢和敗血癥，病死率高[17]。本研究中，凝結(jié)芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用判定為“高敏感”。嚴濤等[13]報道，從泡菜中分離的5 株凝結(jié)芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌均有較強的抑制作用，這與本試驗結(jié)果一致。相反，廣譜抗菌藥物金霉素、土霉素對豬霍亂沙門氏菌無抑制作用。王俊紅[17]發(fā)現(xiàn)豬霍亂沙門氏菌對土霉素有較強耐藥性。以上表明，相比于金霉素、土霉素對豬霍亂沙門氏菌無抑制作用的結(jié)果，凝結(jié)芽孢桿菌具有開發(fā)應(yīng)用于預(yù)防與治療仔豬副傷寒的潛力。

大腸桿菌K88、大腸桿菌K99 和雞白痢沙門氏菌是畜禽腸道最常見的致病菌，嚴重引發(fā)豬、雞腹瀉，降低生產(chǎn)性能[18-19]。本研究結(jié)果顯示，凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99 和雞白痢沙門氏菌的抑制作用均為“敏感”。汪攀等[14]采用牛津杯法研究結(jié)果也顯示，凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K99 具有顯著的抑制作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌抑制大腸桿菌K99 的效果等同于廣譜抗菌藥物土霉素，且強于金霉素。此外，凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88 和雞白痢沙門氏菌有抑制作用，這與前人的報道基本一致[11,14]，且本研究進一步證明了凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88 和雞白痢沙門氏菌的抑制效果弱于金霉素和土霉素。

以上分析綜合表明，凝結(jié)芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制效果優(yōu)于廣譜抗菌藥物金霉素和土霉素，對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99 和雞白痢沙門氏菌有顯著抑制作用。因此，針對畜禽腸道主要有害菌而言，飼用益生菌凝結(jié)芽孢桿菌具有替代抗生素抑菌，進而改善畜禽生產(chǎn)性能的潛能。以上牛津杯抑菌試驗結(jié)果也與飼用凝結(jié)芽孢桿菌對豬雞生長性能及腸道菌群影響的研究結(jié)果一致[3,5,20]。

3.2 凝結(jié)芽孢桿菌對腸道主要有益菌的抑制作用 乳酸桿菌是豬雞等畜禽腸道的主要有益菌，對維持腸道菌群平衡、保障機體健康有重要作用[21]。畜禽腸道中乳酸桿菌的種屬很多，其中羅伊氏乳酸桿菌分布最廣泛、比例最高[22]。本試驗首次對比研究了凝結(jié)芽孢桿菌、金霉素和土霉素對羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用，結(jié)果顯示凝結(jié)芽孢桿菌對羅伊氏乳酸桿菌沒有抑制作用；而金霉素和土霉素對羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用達到“高敏感”。因此，就畜禽腸道主要有益菌而言，飼用益生菌凝結(jié)芽孢桿菌在維持腸道菌群平衡方面的作用效果，顯著優(yōu)于飼用抗生素。動物飼養(yǎng)試驗研究也顯示，飼糧單一添加適合劑量的凝結(jié)芽孢桿菌能夠維持或提高腸道乳酸桿菌數(shù)量，從而有效替代抗生素改善仔豬和肉雞生長性能[3,5,23-24]。

3.3 凝結(jié)芽孢桿菌對飼料源有害菌金黃色葡萄球菌的抑制作用 金黃色葡萄球菌是飼料及飼料原料的主要污染有害菌之一，動物攝入污染金黃色葡萄球菌的飼料，腸道及肝臟等組織受到細菌及毒素的損傷，從而嚴重降低生產(chǎn)性能，增加死亡的概率[25]。本試驗中，凝結(jié)芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用為“敏感”（DIZ=14.7 mm）。張韻等[11]檢測凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號BC147）對金黃色葡萄球菌的DIZ 為14.5 mm；姚曉紅等[9]和趙鈺等[10]的報道也判定凝結(jié)芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌的抑菌作用為“敏感”。此外，本研究進一步對比了凝結(jié)芽孢桿菌與廣譜抗生素金霉素、土霉素對金黃色葡萄球菌的抑制效果，結(jié)果顯示金霉素、土霉素對金黃色葡萄球菌的抑制作用達到“高敏感”，顯著高于凝結(jié)芽孢桿菌。以上結(jié)果表明，從降低畜禽感染金黃色葡萄球菌的危害而言，飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌具有一定的作用，但效果弱于金霉素和土霉素。

3.4 凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)飼用益生菌的抑制作用 我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)范的飼用益生菌有34 種（《飼料添加劑品種目錄》，2013），其中以單一菌或復(fù)合菌在飼料及養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的包括芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌）、乳酸菌（屎腸球菌、糞腸球菌）、酵母菌（產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母）等[7]。本試驗中，凝結(jié)芽孢桿菌對糞腸球菌的抑制作用判定為“不敏感”，與陳桂芳等[26]報道一致；首次發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌對產(chǎn)朊假絲酵母沒有抑制作用。以上結(jié)果表明，凝結(jié)芽孢桿菌與糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母沒有拮抗效應(yīng)。

本研究顯示，凝結(jié)芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌的抑制作用達到“敏感”水平。姚曉紅等[9]用牛津杯法的研究結(jié)果顯示，3 株凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號B4、BFS-2、NJ）對枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用。趙鈺等[10]也用牛津杯法評估得出凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號LL1103）對枯草芽孢桿菌有抑制作用的結(jié)論。隨后，F(xiàn)u 等[12]再次證明凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號L1208）對枯草芽孢桿菌有抑制作用。然而，劉全永等[27]報道，其篩選的凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號LU-B02）對枯草芽孢桿菌沒有抑制作用。筆者推測，以上凝結(jié)芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌抑制作用結(jié)果出現(xiàn)差異主要有兩方面的原因：其一，不同凝結(jié)芽孢桿菌菌株的抑菌性能有差異[9]；其二，不同枯草芽孢桿菌的菌株性能差異較大?？莶菅挎邨U菌是我國最早、也是當前應(yīng)用最廣泛的飼用益生菌，因此目前飼料與畜牧行業(yè)應(yīng)用的商業(yè)飼用枯草芽孢桿菌的菌株繁多，菌株性能差異較大。大量已報道的動物飼養(yǎng)試驗也證明，飼用枯草芽孢桿菌在同一類型動物生長性能上的表現(xiàn)差異巨大[3,28]。

本試驗首次研究了凝結(jié)芽孢桿菌對行業(yè)應(yīng)用較為廣泛的飼用益生菌地衣芽孢桿菌、屎腸球菌的抑制作用，結(jié)果顯示凝結(jié)芽孢桿菌對地衣芽孢桿菌、屎腸球菌的抑制作用判定為“敏感”。這表明凝結(jié)芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌、屎腸球菌有一定的拮抗效應(yīng)。進一步分析顯示廣譜抗菌藥物金霉素、土霉素對地衣芽孢桿菌和屎腸球菌的抑制作用達到“高敏感”，其抑制效果顯著高于凝結(jié)芽孢桿菌。這可能是以往我國商業(yè)飼料在普遍含有多種飼用抗生素基礎(chǔ)上，再添加地衣芽孢桿菌、屎腸球菌等飼用益生菌，未能進一步提高畜禽生產(chǎn)性能的主要原因之一[6,29-30]。

以上結(jié)果提示，凝結(jié)芽孢桿菌與糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母沒有拮抗效應(yīng)，可在商業(yè)飼料及飼料添加劑中復(fù)合使用。鑒于凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、屎腸球菌有拮抗效應(yīng)，在商業(yè)飼料及飼料添加劑中復(fù)合使用需謹慎考慮。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，凝結(jié)芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用達到“高敏感”，對大腸桿菌K88 和K99、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的抑制作用為“敏感”，且對腸道有益菌羅伊氏乳酸桿菌“不敏感”，這從體外抑菌試驗角度驗證了飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌具有抑制畜禽腸道有害菌、維持腸道有益菌、平衡腸道菌群的促生長作用。建議商業(yè)復(fù)合飼用益生菌要充分考慮凝結(jié)芽孢桿菌與其他飼用益生菌菌株之間可能的拮抗效應(yīng)。

致謝：感謝云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院葛長榮教授對文稿所提的寶貴意見。