任紅宇，王艷晴，李一楠，趙 娜，秦 天

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia，Sp)所致肺炎是社區(qū)獲得性肺炎之一,占社區(qū)獲得性肺炎的15%，致死率可達(dá)25%[1-3]。輕者導(dǎo)致細(xì)菌性肺炎，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為菌血癥和細(xì)菌性腦膜炎[4]。全球范圍內(nèi)，每年估計(jì)由肺炎鏈球菌引起的腦膜炎病例大約為32 500例、菌血癥637 000例、肺炎2 000萬例，5歲以下兒童死亡原因中，肺炎占15%[5-6]。雖然肺炎鏈球菌可分為46個(gè)血清群、90多個(gè)血清型，但只有其中的20多個(gè)血清群/型可以導(dǎo)致疾病[7-8]，要準(zhǔn)確鑒定肺炎鏈球菌的群/型別才能及時(shí)確定治療方案[9]。目前用于預(yù)防由這些血清群/型引起的感染有如下幾種疫苗：分別是肺炎鏈球菌23價(jià)多糖疫苗(PPV23)、10價(jià)結(jié)合疫苗(PCV10)、7價(jià)結(jié)合疫苗(PCV7)、13價(jià)結(jié)合疫苗(PCV13)[10-12]。因?yàn)橐呙绲耐茝V、應(yīng)用、研發(fā)以及抗生素的規(guī)范使用是基于臨床分離株不斷監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)上的，且肺炎球菌的血清群/型會(huì)隨著時(shí)間的推移而變化[13]。因此，監(jiān)測(cè)侵襲性肺炎鏈球菌的血清群/型以及耐藥譜特性顯得尤為重要。本研究以臨床患者不同類型樣本為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行血清分群/型，同時(shí)，對(duì)102株侵襲性肺炎鏈球菌進(jìn)行24種抗生素敏感性檢測(cè)，旨在了解來源于不同標(biāo)本類型侵襲性肺炎鏈球菌血清群/型的分布情況以及耐藥特性，從而更好地指導(dǎo)疫苗使用和臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 從中國CDC傳染病所呼吸道傳染病室菌株庫中，選取2011-2014年分離自臨床病人的102株菌株。分別是內(nèi)蒙古26株(血液分離株22株、胸水分離株4株)；寧夏20株(血液分離株12株、腦脊液分離株6株、胸水分離株1株、穿刺液分離株1株)；四川省19株及遼寧省37株均來自血液分離株。

1.2 主要試劑和儀器 PCR擴(kuò)增儀為美國 BIO-RADPT-200，凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad Geldoc XR，TaqDNA聚合酶、dNTPs、100 bp DNAMarker均購自大連寶生物TaKaRa公司，超純水購自美國Gibical公司，DNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，血清分型試劑盒PNEUMOTEST購自丹麥血清學(xué)研究所(Statens Serum Institute，SSI)，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，細(xì)菌比濁儀購自美國BD公司，藥敏板和全自動(dòng)藥敏分析儀均購自山東鑫科生物科技股份有限公司，二氧化碳孵箱購自日本三洋公司，PCR引物由諾和公司合成，細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基購自O(shè)XICD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 采用PCR方法進(jìn)行初步鑒定 如下表所示引物序列基于莢膜合成基因簇來控制所有血清群/型莢膜合成，從而進(jìn)行不同的血清群/型分型組合[14-16]。該方法包含8個(gè)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分別是：①6、3、19A、22A/F； ②8、33F/A/37、15A/15/F、7F/7A/、23A; ③19F、12F/12A/44/46、11A/11D；④24A/24B/24F、7C/7B/40、4、18、9V/9A；⑤14、1、23F、15B/15C、10A；⑥39、10F/10C/、33C、5；⑦23B、35A/35C/42、34、9N/9L、31；⑧21、2、20、13。每個(gè)多重PCR反應(yīng)中各包含4～5對(duì)分群/型引物以及鑒定肺炎鏈球菌種的引物CPS。擴(kuò)增體系是25 μL/個(gè)反應(yīng)；擴(kuò)增條件是95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s、54 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s (30個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠(含DNA染料4 μL/100 mL，100 V電泳80 min。同時(shí)加100 bp marker以判斷結(jié)果。未包含在擴(kuò)增體系中的血清型17A直接進(jìn)行血清分型。見表1。

表1 肺炎鏈球菌血清型分型引物序列Tab.1 Primer sequence for serotyping of Streptococcus pneumoniae

1.3.2 血清分群/型 全部菌株接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，置5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。用無菌棉簽刮取新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌，溶于0.85%的NaCl溶液中，比濁3.0麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?。分別吸取分群/型血清、菌懸液和1%甲基蘭溶液各5 μL于載玻片上，混合均勻，蓋上蓋玻片，100X油鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。如果莢膜漲起(菌體自身腫脹)、菌體周圍可見邊界清晰的無色環(huán)狀物，為陽性試驗(yàn)結(jié)果。采用該方法對(duì)全部分離菌株進(jìn)行血清分群/型實(shí)驗(yàn)[17]。

1.3.3 耐藥檢測(cè) 細(xì)菌培養(yǎng)及濃度測(cè)定：用棉拭子刮取適量新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌于細(xì)菌稀釋液中，測(cè)定和調(diào)整比濁值為0.5麥?zhǔn)蠁挝?Mc Farland)。取50μL 該細(xì)菌菌懸液于12mL藥敏接種培養(yǎng)液中進(jìn)行稀釋并混勻，自動(dòng)加樣器各取100 μL分別加入藥敏培養(yǎng)板各孔。該培養(yǎng)板包括3組抗生素：A組(常規(guī)、首選實(shí)驗(yàn)的抗菌藥物)有紅霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素、青霉素口服、青霉素注射劑、阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素；B組(首選實(shí)驗(yàn)但選擇性報(bào)告的抗菌藥物)有頭孢曲松、美羅培南、頭孢噻肟、頭孢吡肟、四環(huán)素、莫西沙星、左氧氟沙星、萬古霉素、多西環(huán)素、吉米殺星；C組(替代性或補(bǔ)充性抗菌藥物)有利福平、阿莫西林/克拉維酸、頭孢呋辛(注射)、頭孢呋辛(口服)、利奈唑胺、氯霉素。37 ℃ 5% CO2孵箱孵育18 h判讀結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)分別用大腸埃希菌ATCC25922和肺炎鏈球菌ATCC49619對(duì)藥敏接種培養(yǎng)液做質(zhì)控、質(zhì)量檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 102株侵襲性Sp血清分群/型結(jié)果 其中96株(94.12%)通過PCR法鑒定出血清群/型，6株(5.88%)通過莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)鑒定出明確的血清群/型。共分成21個(gè)血清群，包括19、6、14、23、35/42、34、3、22、15、1、18、4、5、7、8、10、11、13、17、20、33。盡管其中的18個(gè)血清群為23價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗(PPV23)所覆蓋，但這18個(gè)血清群中包含的血清型如6A(3株)、6C(4株)、6D(4株)、15C(1株)、23B(2株)、22A(4株)、18A(1株)、18F(1株)、7B(1株)、17A(1株)未在23價(jià)疫苗之列；另外還有35/42群(6株)、34群(5株)、13群(1株)3個(gè)血清群也是23價(jià)疫苗沒有覆蓋到的。23價(jià)疫苗以外血清群/型合計(jì)33株，占總株數(shù)的32.35%。全部實(shí)驗(yàn)用菌株中主要流行血清群依次為(前3位)：血清群19(26.47%)、血清群6(17.65%)、血清群14(14.71%)，占總株數(shù)的58.83%。且35/42群、34群排在21個(gè)血清群中的第5位和第6位。見表2。

表2 102株Sp血清群分布結(jié)果Tab.2 Serogrouping results of 102 Sp strains

2.2 不同標(biāo)本類型血清分群/型結(jié)果 102株菌株來源于血液、腦脊液、胸水和穿刺液4種標(biāo)本類型。其中90株分離自血液，分成18個(gè)血清群；另3種類型標(biāo)本共分離到12株菌株，鑒定出8個(gè)群。見表3。

表3 不同分離部位102株侵襲性SP血清分型結(jié)果Tab.3 Serotyping results of 102 SP strains isolated from different sites

2.3 102株侵襲性Sp耐藥結(jié)果 耐藥率從高到低依次為：阿奇霉素、地紅霉素、克拉霉素、紅霉素、四環(huán)素、克林霉素、復(fù)方新諾明、頭孢呋辛(注射)、頭孢呋辛(口服)、青霉素(口服)、氯霉素、頭孢塞肟、青霉素(注射)、萬古霉素、利奈唑胺、美羅培南、利福平、左氧氟沙星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢吡肟、莫西沙星、頭孢曲松、多西環(huán)素、吉米沙星。耐藥率在90%以上的是阿奇霉素、地紅霉素、克拉霉素、紅霉素；耐藥率在50%以上的是四環(huán)素、克林霉素、復(fù)方新諾明；耐藥率在10%～50%之間的是頭孢呋辛(注射)、頭孢呋辛(口服)、青霉素(口服)、氯霉素、頭孢塞肟；耐藥率在10%以下的是青霉素(注射)、萬古霉素、利奈唑胺、美羅培南、利福平、左氧氟沙星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢吡肟；耐藥率為0的是莫西沙星、頭孢曲松、多西環(huán)素、吉米沙星。見表4。

表4 102株侵襲性Sp對(duì)24種抗生素耐藥結(jié)果Tab.4 Resistance of 102 invasive Sp strains to 24 antibiotics

3 討 論

肺炎鏈球菌可經(jīng)呼吸道進(jìn)行自體轉(zhuǎn)移,也可經(jīng)飛沫、分泌物傳播,主要危害人群為兒童和老年人,尤其是嬰幼兒。在機(jī)體免疫力減弱時(shí),被感染者發(fā)生浸潤(rùn)感染,引起鼻竇炎、肺炎、腦膜炎、中耳炎等嚴(yán)重侵襲性疾病。本研究選用的102株肺炎鏈球菌分離自臨床患者血液、腦脊液、胸水、穿刺液等，屬于侵襲性菌株[18]。 結(jié)合EUCAST和臨床推薦對(duì)24種抗生素進(jìn)行敏感性檢測(cè)[19]。3組耐藥數(shù)據(jù)表明，耐藥率<10%的A組只有青霉素注射劑(5.88%)1種抗生素；B組有吉米沙星(0%)、多西環(huán)素(0%)、莫西沙星(0%)、頭孢曲松(0%)、頭孢吡肟(1.96%)、左氧氟沙星(2.94%)、美羅培南(3.92%)、萬古霉素(5.88%) 8種抗生素；C組有利福平(2.94%)、阿莫西林/克拉維酸(1.96%)、利奈唑胺(3.92%)3種抗生素。由此可見，在治療由侵襲性Sp引起的感染時(shí)上述11種抗生素可以選用。

研究Sp血清分群/型對(duì)于合理指導(dǎo)臨床用藥意義重大,目前全世界已發(fā)現(xiàn)46個(gè)血清群,90 多個(gè)血清型,而其中與肺炎鏈球菌疫苗相關(guān)的僅有20余種[20-21]。研究102株侵襲性Sp分成21個(gè)血清群。其中含10株以上的血清群是19群(27株)、6群(19株)、14群(14株) ,合計(jì)60株，占到總實(shí)驗(yàn)株數(shù)的58.82%。與高占成等研究結(jié)果一致[22]。我們推測(cè)上述3個(gè)血清群應(yīng)是我國的優(yōu)勢(shì)血清群。

來源于血液標(biāo)本的菌株分成18個(gè)血清群，來源于腦脊液、胸水等標(biāo)本的菌株分成8個(gè)血清群。不同類型標(biāo)本血清群不完全相同。血液中分離的血清群以6群、19群和23群為主，而腦脊液中分離的血清群/型除了包含在血液中分離的血清型別外，還有如33群、18F血清型、7B血清型等獨(dú)有的型別。這些血清群/型都不在23價(jià)疫苗覆蓋范圍。此外，6群19株菌株共分成A、B、C、D 4個(gè)血清型，其中3個(gè)血清型(6A、6C、6D)未在23價(jià)疫苗覆蓋范圍之內(nèi)，占6群的57.89%(11/19)。另外，13、34、35/42 血清群也未在疫苗覆蓋范圍，它們分別來源于血液的13血清群(1株)，34血清群(4株)、35/42血清群(6株)以及來源于胸水的34血清群(1株)。綜上所述，分離自不同類型標(biāo)本的血清群/型未完全覆蓋在23價(jià)疫苗中。所以筆者認(rèn)為應(yīng)加大腦脊液、胸水等標(biāo)本的監(jiān)測(cè)，以充分了解血清群/型分布及其變化，為研發(fā)新的更多種的疫苗提供數(shù)據(jù)。

Sp的耐藥形勢(shì)十分嚴(yán)峻，特別是多重耐藥現(xiàn)象。要綜合考慮患者病情及其本地區(qū)肺炎鏈球菌血清分布與耐藥性情況，同時(shí)，在條件許可下盡量根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)結(jié)果來合理使用抗生素。盡管中國在2017年引入了PCV13，但疫苗接種率仍然很低。在我們處理肺炎鏈球菌引起的感染性疾病時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注增加肺炎球菌疫苗的接種率、減少抗生素的不當(dāng)使用，有針對(duì)性地進(jìn)行預(yù)防。