王 軒，楊秀玉，韓寧寧，戴 青，汪 霞，趙 暉

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

替米考星(C46H80N2O13)是一種動(dòng)物專用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要用于治療胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌及支原體感染等，比泰樂(lè)菌素具有更強(qiáng)的抗菌活性[1-2]。替米考星在獸醫(yī)臨床治療中已得到非常廣泛的應(yīng)用，且擁有多種劑型。《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版一部[3]共收載替米考星原料及替米考星注射液、替米考星預(yù)混劑和替米考星溶液三種制劑類型，其含量測(cè)定方法均為高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃(805∶115∶25∶55)為流動(dòng)相，按外標(biāo)法以替米考星順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體峰面積的和計(jì)算含量。但在實(shí)際使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該色譜條件下替米考星的順-8-差向異構(gòu)體峰位于其順式異構(gòu)體峰和反式異構(gòu)體峰之間，但現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)替米考星順式異構(gòu)體峰和反式異構(gòu)體峰的分離度進(jìn)行控制，故順-8-差向異構(gòu)體峰易對(duì)替米考星含量測(cè)定結(jié)果造成干擾[3]。同時(shí)，在該流動(dòng)相體系中含有四氫呋喃，易對(duì)以塑料管為輸液介質(zhì)的液相色譜儀造成損害，大大縮短儀器的使用壽命，增加試驗(yàn)成本。已發(fā)表的文獻(xiàn)中，替米考星及其制劑的含量測(cè)定方法以高效液相色譜法為主[4-6]，色譜條件與《中國(guó)獸藥典》標(biāo)準(zhǔn)大多一致。因此，建立一種便捷、高效的替米考星的含量測(cè)定方法是非常必要的。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 Waters 2695高效液相色譜儀配有二極管陣列檢測(cè)器(PDA2998)和色譜工作站處理軟件Empower 3(美國(guó)Waters公司)、AX205型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。三氟乙酸、乙腈為色譜純，水為超純水。

1.2 試藥 替米考星對(duì)照品，批號(hào)K0311805，含量95.3%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；替米考星溶液，某市售產(chǎn)品，規(guī)格25%；替米考星預(yù)混劑，某市售產(chǎn)品，規(guī)格10%；替米考星注射液，某市售產(chǎn)品，規(guī)格10 mL∶3 g。

2 溶液的制備

2.1 對(duì)照品溶液 取替米考星對(duì)照品約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入2 mL乙腈，用35%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液 替米考星預(yù)混劑：取供試品約2.5 g(相當(dāng)于替米考星0.25 g)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入2 mL乙腈，用35%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，超聲10 min，搖勻，精密量取上述溶液5 mL置50 mL量瓶中，用35%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，即得；替米考星注射液：精密量取供試品2 mL，用35%乙腈溶液稀釋至刻度，超聲10 min，搖勻，精密量取上述溶液5 mL置50 mL量瓶中，用35%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，即得；替米考星溶液：精密量取供試品2 mL，用35%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液5 mL置50 mL量瓶中，用35%乙腈溶液稀釋至刻度，超聲10 min，搖勻，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：10%三氟乙酸-乙腈(65∶35)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 專屬性和系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，樣品中雜質(zhì)對(duì)替米考星的測(cè)定無(wú)干擾。替米考星的順式和反式異構(gòu)體峰的分離度為1.92，理論塔板數(shù)按順式計(jì)為14051，按反式計(jì)為6208，替米考星反式異構(gòu)體峰、順式異構(gòu)體峰和順-8-差向異構(gòu)體的相對(duì)保留時(shí)間為0.9、1.0和1.2。對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 替米考星對(duì)照品(A)、替米考星預(yù)混劑(B)、替米考星注射液(C)和替米考星溶液(D)的色譜圖Fig 1 Chromatograms of tilmicosin reference (A), tilmicosin premix (B), tilmicosin injection (C), and tilmicosin solution (D)

3.2 線性關(guān)系考察 取替米考星對(duì)照品約100 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用35%乙腈稀釋制成2.0、1.0、0.5、0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/mL的系列對(duì)照品溶液。照2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以對(duì)照品濃度C為橫坐標(biāo)，以替米考星順式峰和反式峰的峰面積和A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程及相關(guān)系數(shù)為：A=12 106 885C+61423，R2=0.9998。結(jié)果表明，替米考星在0.01～2.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.3 檢測(cè)限和定量限 取對(duì)照品溶液適量，用35%乙腈逐級(jí)稀釋，照2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以信噪比S/N為3和10求得替米考星檢測(cè)限為0.8 μg/mL，定量限為2.7 μg/mL。

3.4 準(zhǔn)確度 以回收率試驗(yàn)考察方法的準(zhǔn)確度。取替米考星對(duì)照品適量，精密稱定，加入2 mL乙腈，用35%乙腈制成每1 ml中約含替米考星10 mg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置200 mL量瓶中，用35%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取替米考星預(yù)混劑供試品約0.25 g(相當(dāng)于替米考星25 mg)、替米考星溶液0.1 mL，分別置于50 mL量瓶中，分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.00、1.25、1.50 mL，加入同一量瓶中，照2.2項(xiàng)下方法配制，每個(gè)濃度平行制備3份，得到預(yù)混劑回收率溶液和溶液回收率溶液；取替米考星注射液0.1 mL，置50 mL量瓶中，分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.20、1.50、1.80 mL，加入同一量瓶中，照2.2項(xiàng)下方法配制，每個(gè)濃度平行制備3份，得到注射液回收率溶液。將對(duì)照品溶液、預(yù)混劑回收率溶液、注射液回收率溶液和溶液回收率溶液照2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率?；厥章试囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Recoveries of tilmicosin in premix, injection, and solution

3.5 精密度 精密吸取同一對(duì)照品溶液，照2.3項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄替米考星反式峰和順式峰的峰面積和為6869759、6838430、6867163、6839803、6825560，RSD為0.3%，反式峰保留時(shí)間為15.935、15.834、15.753、15.694、15.638 min，RSD為0.7%，順式峰保留時(shí)間為17.184、17.080、16.983、16.921、16.855 min，RSD為0.8%。結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取不同制劑的同一批供試品，照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，照2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。替米考星預(yù)混劑的平均含量為95.8%，RSD為0.8%；替米考星注射液的平均含量為103.9%，RSD為0.2%；替米考星溶液的平均含量為102.6%，RSD為0.8%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份對(duì)照品溶液和替米考星預(yù)混劑供試液，室溫放置，分別在0、6、12、16、20、36和48 h照2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，48 h內(nèi)替米考星對(duì)照品和替米考星預(yù)混劑的順式峰和反式峰面積和的RSD分別為0.43%和0.58%。結(jié)果表明制備好的對(duì)照品溶液和供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 耐用性試驗(yàn) 從柱溫、流動(dòng)相組成、色譜柱三方面考察替米考星檢測(cè)方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫為25 ℃、30 ℃和35 ℃，結(jié)果表明，隨著柱溫升高，替米考星峰的保留時(shí)間逐漸前移，替米考星順式峰和反式峰的分離度均符合要求；調(diào)節(jié)流動(dòng)相組成為10%三氟乙酸-乙腈(60-40)、10%三氟乙酸-乙腈(65-35)、和10%三氟乙酸-乙腈(70-30)，結(jié)果顯示，在不同流動(dòng)相組成下，替米考星順式峰和反式峰的分離度均符合要求；選擇3款不同品牌色譜柱(Dikma Diamonsil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm； Alltima C18，4.6 mm×250 mm，5 μm； Gemini C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)，考察不同色譜柱對(duì)測(cè)定的影響，三款色譜柱結(jié)果顯示，除保留時(shí)間有差異外，替米考星順式峰和反式峰的分離度均符合要求。

4 樣品的測(cè)定

取替米考星預(yù)混劑、替米考星注射液和替米考星溶液各一批，按2.2項(xiàng)下方法處理，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行制備兩份，取平均值計(jì)算樣品中替米考星含量。同時(shí)，使用《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版一部收載的含量測(cè)定方法對(duì)三批樣品進(jìn)行測(cè)定，并與本方法結(jié)果進(jìn)行比較，見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)Tab 2 The results of the sample content (n=2)

5 討論與結(jié)論

5.1 色譜條件的選擇 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中，替米考星及其制劑含量測(cè)定方法的流動(dòng)相均采用乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃體系[7-9]，已發(fā)表的文獻(xiàn)中也僅有一篇提出在流動(dòng)相中可加入三氟乙酸以改善分離[10]。本實(shí)驗(yàn)中配制了不同濃度的三氟乙酸溶液(1%、5%、10%和20%)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)三氟乙酸濃度較低時(shí)，替米考星順式峰和反式峰間的分離度小于1.5，當(dāng)使用10%三氟乙酸-乙腈(65∶35)為流動(dòng)相時(shí)，替米考星順式峰和反式峰可實(shí)現(xiàn)基線分離。

5.2 提取溶劑的選擇 本方法比較了使用乙腈、甲醇、35%乙腈溶液作為提取溶劑對(duì)替米考星的影響，結(jié)果顯示使用35%乙腈溶液效果最佳，在替米考星預(yù)混劑提取過(guò)程中先加入2 mL乙腈助溶以增加提取效率；分別比較了超聲2、5、10 min對(duì)提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲10 min能夠提取完全。

5.3 注意事項(xiàng) 本方法對(duì)針對(duì)替米考星及其制劑含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，將原方法中流動(dòng)相組成由水-乙腈-磷酸丁二胺-四氫呋喃體系轉(zhuǎn)變?yōu)?0%三氟乙酸-乙腈體系。三氟乙酸具有揮發(fā)性和一定的腐蝕性，在流動(dòng)相配制過(guò)程中應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，做好自身防護(hù)措施，可對(duì)試驗(yàn)人員進(jìn)行有效防護(hù)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)注意對(duì)色譜流路及色譜柱進(jìn)行沖洗，可先用10倍柱體積低濃度的甲醇/乙腈-水溶液(約10%)進(jìn)行沖洗，再用較高濃度的甲醇/乙腈-水溶液(約50%)進(jìn)行沖洗，最后用高濃度的甲醇/乙腈-水溶液(80%以上)進(jìn)行沖洗，使得色譜柱中強(qiáng)吸附物質(zhì)沖洗出來(lái)，同時(shí)可將系統(tǒng)中的三氟乙酸完全沖洗干凈，減少其對(duì)儀器設(shè)備的損耗。

5.4 結(jié)論 本方法建立了一種用于替米考星及其制劑含量測(cè)定的高效液相色譜檢測(cè)方法。與現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》2015年版一部標(biāo)準(zhǔn)相比，該方法操作簡(jiǎn)便，并能夠有效將順-8-差向異構(gòu)體進(jìn)行分離，提高了替米考星及其制劑質(zhì)量控制的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)提升提供了方法學(xué)依據(jù)。