曹麗茹 王國瑞 張 新 魏良明 魏 昕 張前進 鄧亞洲 王振華 魯曉民

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，450002，河南鄭州）

近年來，隨著全球氣溫升高，干旱、高溫、高鹽等多種非生物脅迫頻發(fā)，對農(nóng)作物的正常生長產(chǎn)生較大影響。據(jù)統(tǒng)計，我國干旱及半干旱的地區(qū)土地面積占可耕地面積的一半以上，干旱對我國糧食的產(chǎn)量安全構(gòu)成了巨大的威脅[1]。種植抗旱性強的品種是應(yīng)對干旱脅迫較為經(jīng)濟有效的途徑之一，從分子水平解析植物抗旱機制，培育作物抗旱新品種已然成為一種新的育種途徑。

熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一種在自然界分布廣泛、具有序列高度保守性等特點的應(yīng)激蛋白，根據(jù)其蛋白分子量大小可分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60和 sHsps五大類[2]。Hsp90家族蛋白是熱激蛋白家族的重要成員，具有明顯的3個區(qū)域：含有ATP結(jié)合和水解位點的N末端、中部區(qū)域（M）和包含二聚化作用區(qū)域的 C末端結(jié)構(gòu)域[3-4]。Hsp90蛋白廣泛參與植物的生長發(fā)育，在種子萌發(fā)、幼苗生長等生命進程中起著關(guān)鍵的作用[5-6]，其還具有伴侶活性，在蛋白的折疊、加工運輸及降解等過程中扮演著重要角色[2]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生物體受到外界刺激或非生物脅迫時，該類蛋白基因會大量表達，從而增強生物體對外界的適應(yīng)能力。

熱激蛋白在植物生長發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中扮演重要的角色。擬南芥、水稻和小麥等植物中的關(guān)于 HSP90響應(yīng)逆境脅迫的報道較多，在模式植物擬南芥中，共有7個HSP90蛋白被發(fā)現(xiàn)，分別過表達AtHsp90.2、AtHsp90.5和AtHsp90.7基因的擬南芥植株在鹽脅迫和干旱脅迫下，其發(fā)芽率和鮮重均明顯低于野生型，表明過表達這些基因降低了植株的耐鹽性和抗旱能力[9]。而水稻中發(fā)現(xiàn)有9個HSP90家族蛋白基因，OsHSP90-2和OsHSP90-4基因在熱脅迫和干旱脅迫下的表達量增加；在酵母細(xì)菌中過表達OsHSP90-2基因，增強了其對熱脅迫和干旱脅迫的耐受性；過表達OsHSP90-4的水稻植株耐熱性增強[10]。小麥中的18個HSP90蛋白基因?qū)崦{迫響應(yīng)程度不同[11]。

玉米中關(guān)于HSP90家族基因的逆境響應(yīng)研究報道較少。本研究根據(jù)HSP90基因家族成員的功能結(jié)構(gòu)域，從玉米全基因組中篩選HSP90家族成員，對其進化樹、保守基序（motif）、組織表達模式、響應(yīng)干旱脅迫和復(fù)水過程進行分析，并預(yù)測蛋白互作關(guān)系，為進一步探究ZmHSP90家族成員的功能和作用機制提供參考，為培育抗旱新品種提供分子資源。

1 材料與方法

1.1 玉米HSP90基因的鑒定

從 Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/Zea_mays/Info/Index）數(shù)據(jù)庫中下載玉米蛋白序列搭建Blast數(shù)據(jù)庫，以HATPase_c和HSP90結(jié)構(gòu)域（PF00183）為依據(jù)進行Blastp搜索（E≤10-5）。利用CDD（http://www.Ncbi.Nlm.Nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和 ProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）數(shù)據(jù)庫對其蛋白結(jié)構(gòu)域進行核對并去除冗余序列。從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫中獲得HSP90蛋白基因的染色體定位及位置、內(nèi)含子數(shù)量、開放閱讀框長度、編碼氨基酸長度及編碼蛋白分子質(zhì)量和等電點及GO信息等。利用在線工具 Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測玉米HSP90蛋白的亞細(xì)胞定位[12]。

1.2 HSP90蛋白的進化樹與序列分析

利用MEGA 6.0（最大臨近法，Bootstrap設(shè)置1000次）對從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫中下載的玉米、擬南芥和高粱的 HSP90蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹分析。利用TBtools軟件對玉米HSP90蛋白進行基因結(jié)構(gòu)分析[10]。利用在線工具MEME（http://memesuite.org/）對玉米HSP90蛋白進行motif分析。

1.3 玉米HSP90家族基因的組織表達模式分析

為了獲取玉米 HSP90蛋白基因在各組織的表達情況，從Expression Atlas（http://www.ebi.ac.uk/gxa/home）數(shù)據(jù)庫中下載玉米 HSP90蛋白基因在根、莖、葉、花粉、雄穗、雌穗、胚乳和萌發(fā)2d的籽粒8個組織或器官的表達數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件進行整理。

1.4 ZmHSP90-1基因在干旱脅迫中的表達分析

試驗材料選用前期篩選到的強抗旱（母本鄭8713，M）和干旱敏感（父本鄭K9713，F(xiàn)）2種不同基因型玉米自交系。選取顆粒飽滿一致的鄭8713和鄭K9713種子播種在營養(yǎng)土中，生長至三葉一心時進行干旱脅迫處理，將長勢一致的玉米苗轉(zhuǎn)移至含有20% PEG6000的Hoagland’s營養(yǎng)液中，處理96h后進行復(fù)水處理，分別在處理0、12、24、36、48、60、72、84、96h和復(fù)水后1d和3d時取根、莖和葉于液氮中速凍，存放于-80℃冰箱，用于提取RNA。每個部位3個生物學(xué)重復(fù)。

提取處理樣品的總 RNA，并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA第1鏈作為模板。設(shè)計ZmHSP90-1特異性引物（F：5’-GTGACACGTCAGGGGAGC-3’，R：5’-CCAC AGGGAGATGGGGTA-3’），以玉米18rRNA（F：5’-CCTGCGGCTTAATTGACTC-3’，R：5’-GTTAG CAGGCTGAGGTCTGG-3’）為內(nèi)參基因進行定量分析，反應(yīng)體系為Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）10μL，cDNA 1μL，上、下游引物各1μL，超純水補足至20μL。反應(yīng)程序為95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 30s，40 個循環(huán)。根據(jù) 2-△△Ct法計算基因的相對表達量。每個樣品重復(fù)3次。

1.5 ZmHSP90-1的互作蛋白預(yù)測

利用在線工具STRING（https://string-db.org/）預(yù)測ZmHSP90-1的互作蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米HSP90基因的鑒定

從玉米數(shù)據(jù)庫中得到了11個編碼HSP90蛋白的基因，我們將其暫命名為ZmHSP90-1～ZmHSP90-11。由表1可知，ZmHSP90-1～ZmHSP90-11分布在第1、2、3、4、5、6、7、10號染色體上，其中第4、6和7號染色體上均含有2個編碼玉米HSP90蛋白的基因，在第8、9號染色體上未見玉米HSP90蛋白基因。ZmHSP90-1～ZmHSP90-11內(nèi)含子個數(shù)在2～20之間，開放閱讀框長度在2028～2442bp之間，蛋白分子量在77.38～92.87kDa，等電點在4.62～5.03之間。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，編碼ZmHSP90-3、-7、-9、-10蛋白的基因定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，編碼ZmHSP90-2、-8蛋白的基因定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，編碼ZmHSP90-1、-4、-5、-6、-11蛋白的基因則定位在細(xì)胞質(zhì)。玉米HSP90類家族蛋白在氨基酸長度、分子量、等電點和亞細(xì)胞定位等方面相似性較好，表明該類家族蛋白具有較好的序列保守性。

表1 玉米HSP90基因家族Table 1 HSP90 genes family in maize

2.2 玉米HSP90蛋白的進化樹與序列分析

利用MEGA 6.0對玉米、擬南芥和高粱HSP90蛋白進化樹進行分析，結(jié)果（圖 1）顯示，HSP90蛋白可劃分為5個亞族，除了第5亞族不含有擬南芥 HSP90蛋白外，其余每個亞族中均同時含有擬南芥、高粱和玉米HSP90蛋白，表明玉米和高粱具有較高的親緣關(guān)系。

圖1 玉米、擬南芥和高粱HSP90蛋白的進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of HSP70 proteins from maize, arabidopsis and sorghum

對玉米HSP90蛋白進行motif分析，結(jié)果（圖2a）顯示，在進化樹中屬于同一組蛋白的motif在個數(shù)、類型和順序上類似甚至是一致的?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖2b）顯示，ZmHSP90-7、-9具有20個內(nèi)含子，ZmHSP90-3、-10含有 19個內(nèi)含子，ZmHSP90-2、-8含有15個，ZmHSP90-6含有4個，ZmHSP90-11、ZmHSP90-4和ZmHSP90-1均含有3個，ZmHSP90-5含有2個。在進化樹中屬于同一組蛋白的基因的結(jié)構(gòu)類似，推測同一組蛋白在功能方面具有類似的作用。

圖2 玉米HSP90家族成員的motif和基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of HSP90 family motif and gene structure in maize

2.3 玉米HSP90家族基因的GO分析

在生物功能方面，ZmHSP90家族蛋白均參與了蛋白質(zhì)的折疊過程（GO:0006457）。表 2結(jié)果顯示，ZmHSP90-1、-4、-5、-6、-11參與了細(xì)胞對熱的響應(yīng)（GO:0034605），在穩(wěn)定蛋白質(zhì)方面也有功能（GO:0050821）。ZmHSP90-5蛋白還參與了伴侶蛋白介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊（GO:0061077）及對病菌的防御反應(yīng)（GO:0009816）；在分子功能方面，ZmHSP90家族蛋白均可與ATP位點結(jié)合（GO:0005524），除了ZmHSP90-2蛋白外，其余ZmHSP90蛋白均可與某些未知蛋白結(jié)合（GO:0051082），其中ZmHSP90-5蛋白還可以與核酸結(jié)合（GO:0000166）；在細(xì)胞組分方面，ZmHSP90-1、-2、-4、-5、-6、-8、-11主要在細(xì)胞質(zhì)周圍分布（GO:0048471），ZmHSP90-3、-7、-9、-10主要在葉綠體基質(zhì)中分布（GO:0009570）。

表2 玉米HSP90基因家族的GO分析Table 2 GO analysis of maize HSP90 family genes

2.4 玉米HSP90家族基因的表達分析

組織表達結(jié)果（圖3）顯示，ZmHSP90蛋白在玉米組織或器官均有表達，但各基因在不同的部位或者器官的表達量存在差異，基因間也存在較大的差異性。ZmHSP90-1～11在花粉和雌穗中的表達較低，在胚乳、雌穗、根、莖和葉中表達量相對較高。ZmHSP90-5、6、7在各個組織或器官中的表達量相對最小，其中ZmHSP90-5在莖、雌穗、花粉中幾乎不表達，ZmHSP90-2、3、4、8、9、10、11主要在雄穗和胚乳中表達。ZmHSP90-1在各部位或器官的表達量相對較高，且在雄穗中表達量最高，在花粉表達量最低。ZmHSP90-1的高表達暗示著其在玉米正常發(fā)育過程中起著更為重要的作用。

圖3 玉米HSP90家族基因在8個組織的表達譜Fig.3 Expression profile of HSP90 genes family of maize in eight tissues

2.5 干旱脅迫下ZmHSP90-1基因的表達分析

分析干旱脅迫下ZmHSP90-1基因在M和F這2個自交系中的表達模式，發(fā)現(xiàn)ZmHSP90-1基因積極響應(yīng)干旱脅迫，在根、莖和葉中的表達趨勢一致，均在脅迫48h時表達量達到最大。在葉、莖和根3個組織中，ZmHSP90-1在鄭8713中的響應(yīng)強度均大于鄭K9713中，差異倍數(shù)為1.07（圖4a）、1.09（圖4b）、4.98（圖4c）。推測ZmHSP90-1的表達量與玉米自交系的抗旱性強弱存在緊密的聯(lián)系。

對鄭8713中ZmHSP90-1在干旱脅迫中的表達模式進行進一步的分析，結(jié)果（圖4d）顯示，ZmHSP90-1在干旱處理12h開始表達量逐漸上升，在48h時表達量開始快速上升，并在60h達到了最大值，隨后表達量降低。干旱處理96h后進行復(fù)水處理，在復(fù)水1d時表達量較低，隨后升高，暗示ZmHSP90-1基因在玉米響應(yīng)干旱脅迫和干旱―復(fù)水中扮演重要的角色。

圖4 ZmHSP90-1在干旱脅迫下的表達分析Fig.4 Expression analysis of ZmHSP90-1 under drought stress

2.6 預(yù)測ZmHSP90-1的互作蛋白

為了探究ZmHSP90-1基因編碼蛋白的互作關(guān)系，對ZmHSP90-1的互作蛋白進行預(yù)測。結(jié)果（表3）顯示，ZmHSP90-1可能與SGT1類蛋白、伴侶蛋白SBA1、HSP蛋白ATPase的激活劑、蛋白質(zhì)精氨酸 N-甲基轉(zhuǎn)移酶1.5、整合素β-1-結(jié)合蛋白2以及錨蛋白等存在互作關(guān)系，推測ZmHSP90-1可能與這些互作蛋白協(xié)同參與植物的抗病和抗逆等過程。

表3 ZmHSP90-1功能互作蛋白預(yù)測Table 3 Functional interaction protein prediction of ZmHSP90-1 gene

3 討論

本研究從玉米全基因組中鑒定出11個ZmHSP90家族成員。對玉米、擬南芥和高粱的HSP90蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn) HSP90蛋白分為 5個亞族，且在每個亞族中均有ZmHSP90蛋白的存在。同一亞族的ZmHSP90在基因結(jié)構(gòu)、motif分布和數(shù)量、亞細(xì)胞定位方面均有相同或者類似的特征，推測同一亞族ZmHSP90可能存在相似的生物學(xué)功能。有研究[13-15]表明，AtHSP90-5（AT2G04030）參與了擬南芥的生長發(fā)育和葉綠體的形成，對其進行插入突變，導(dǎo)致了其萌芽期死亡。AtHSP90-1（AT5G52640）和AtHSP90-2增強了酵母細(xì)胞在鹽和熱脅迫下的存活率[16]。AtHSP90-7（AT4G24190）通過調(diào)控AtNMig1基因，參與擬南芥響應(yīng)高溫、干旱和高鹽脅迫的過程，暗示其在植物響應(yīng)非生物脅迫中具有重要的作用[17]。本研究對ZmHSP90家族蛋白進行GO富集分析，證實了ZmHSP90家族成員參與相關(guān)蛋白質(zhì)的后期加工，且對熱脅迫響應(yīng)和穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面也起著關(guān)鍵作用，研究結(jié)果與前人結(jié)論[18-20]較為一致。表明ZmHSP90家族基因在植物防御非生物脅迫方面具有積極的作用，有進一步探究其功能和作用機制的價值。

本研究發(fā)現(xiàn)ZmHSP90家族成員在玉米的不同組織或器官中均有表達，其中ZmHSP90-1基因在各組織中的表達量均相對較高，暗示其在玉米的生長發(fā)育中或許起著較為重要的作用。ZmHSP90-1與ZmHSP90-6屬于同一亞家族，有報道[21]證實ZmHSP90-6基因的過表達增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和高溫的耐受性，推測ZmHSP90-1也可能存在類似功能。本研究發(fā)現(xiàn)該基因響應(yīng)干旱脅迫，在干旱脅迫24h時ZmHSP90-1基因的表達量顯著升高，60h時達到峰值，是對照（0h）的近50倍；復(fù)水后，其表達量先顯著下降，然后隨著復(fù)水時間的延長，表達量顯著升高，表明ZmHSP90-1基因正向積極響應(yīng)干旱脅迫和復(fù)水過程。為進一步探究ZmHSP90-1基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究對ZmHSP90-1編碼的蛋白進行互作蛋白預(yù)測，發(fā)現(xiàn)這些互作蛋白參與植物的抗病、調(diào)控植物的非生物脅迫應(yīng)答等過程。研究[22-23]顯示SGT1參與植物抗病、響應(yīng)非生物脅迫等過程；肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶與蛋白質(zhì)的正確折疊有關(guān)，王萍[24]研究發(fā)現(xiàn)棉花肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶基因AY972810在鹽脅迫下表達量升高；棉花的伴侶蛋白SBA1與HSP90蛋白存在相互作用關(guān)系，但SBA1與HSP90結(jié)合會導(dǎo)致ATPase酶活性降低[25]。擬南芥中，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SKB1是植物感知脅迫并調(diào)控發(fā)育過程的重要因子，SKB1的功能缺失會導(dǎo)致擬南芥對鹽脅迫超敏感、生長遲緩及晚花等缺陷[26]。整合素β-1-結(jié)合蛋白2在動物中的研究較多，主要介導(dǎo)細(xì)胞―基質(zhì)間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]。錨蛋白主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)―蛋白質(zhì)的相互作用，廣泛參與細(xì)胞生命活動的調(diào)節(jié)[28]。推測ZmHSP90-1可能與這些潛在的互作蛋白有協(xié)同作用，調(diào)控植物的生長發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫過程。本研究從玉米全基因組水平鑒定出11個ZmHSP90家族成員，對其功能結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、motif、GO富集和組織表達特性進行了系統(tǒng)分析。證實了ZmHSP90-1基因積極響應(yīng)干旱脅迫和復(fù)水過程，同時預(yù)測了潛在互作蛋白及可能存在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進一步探究ZmHSP90-1抗旱功能和作用機制奠定基礎(chǔ)，同時為研究其他ZmHSP90家族成員響應(yīng)逆境脅迫的功能提供參考。

4 結(jié)論

篩選出的 11個玉米ZmHSP90家族基因被劃分為5組，相鄰進化樹分支的同一亞家族蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)域，推測存在類似的生物學(xué)功能。發(fā)現(xiàn)11個ZmHSP90基因在不同組織或器官中均有表達，其中ZmHSP90-1在多個組織和器官中均高表達，且ZmHSP90-1基因在耐旱性強的玉米自交系鄭8713中表達量高于干旱敏感性自交系鄭K9713，說明該基因正向積極響應(yīng)旱脅迫和復(fù)水過程。蛋白互作預(yù)測說明ZmHSP90-1可能與其互作蛋白協(xié)同參與玉米的生長發(fā)育及響應(yīng)非生物脅迫過程。