張應(yīng)宣，徐 潔，岑榮芳

(都勻市疾病預(yù)防控制中心，貴州 都勻 558000)

在艾滋病抗體初篩檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)置外部HIV陽性血清質(zhì)控品，是實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中十分重要的一個(gè)環(huán)節(jié),反映室內(nèi)環(huán)境、設(shè)備、加樣及人員等情況是否處于穩(wěn)定、連續(xù)、可靠、準(zhǔn)確狀態(tài)。室內(nèi)質(zhì)量控制穩(wěn)定與否，是試驗(yàn)結(jié)果好與差的判定和鑒別前提條件[1]。根據(jù)《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》(2020版)的要求，建立與艾滋病抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室相適應(yīng)的室內(nèi)質(zhì)量控制體系，能更好地開展艾滋病抗體初篩實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，保證檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，從源頭上把好質(zhì)量關(guān)[2]。本室對(duì)自備外部質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，獲得的20組數(shù)據(jù)，即質(zhì)控品吸光度(OD)值和離散度(S/CO)值，采用“即刻”法和Levey-Jennings質(zhì)控圖相進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控分析。制備好的外部質(zhì)控品每次試驗(yàn)使用1支，每支0.5 ml，在第一周單獨(dú)測(cè)一次，第二周單獨(dú)測(cè)一次，至第三周起質(zhì)控品和樣本在相同條件下進(jìn)行試驗(yàn)，以此類推，獲得20次及以上的質(zhì)控品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來進(jìn)行質(zhì)控分析，以期了解本單位艾滋病抗體初篩室的室內(nèi)質(zhì)量控制活動(dòng)是否符合實(shí)驗(yàn)要求[3]。

1 材料和方法

1.1 材料 艾滋病抗體檢測(cè)試劑盒(規(guī)格：96/T,麗珠)，可調(diào)式移液器(規(guī)格：10～100 μl)，多功能酶標(biāo)儀(規(guī)格：MB-580，深圳匯松)，外部質(zhì)控品(規(guī)格：0.5 ml/支)，恒溫水浴箱、自動(dòng)洗板機(jī)、加樣槍頭等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)原理 采用雙抗原夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，在微孔條上預(yù)包被高純度重組HIV(1+2型)抗原，加入50 μl樣本后震蕩混勻，置于(37±0.5)℃水浴箱孵育1 h，洗板；加入酶標(biāo)記抗原，震蕩混勻再孵育1 h，洗板；加入顯色劑，震蕩混勻，孵育30 min，滴加終止液，混勻，根據(jù)顯色深淺酶標(biāo)儀讀取光密度OD值及S/CO值。

1.2.2 計(jì)算與繪圖分析 外部質(zhì)控品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(OD值及S/CO值)20次以內(nèi)及以上檢測(cè)記錄結(jié)果，用“即刻”法和L-J質(zhì)控圖聯(lián)合軟件進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算和繪圖分析。

2 結(jié)果

2.1 外部質(zhì)控品選擇 將血清稀釋系列濃度比為：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024；測(cè)得OD值：2.608,3.300，3.300，3.123，2.616，1.882，1.142，0.643，0.360，0.147。質(zhì)控品選擇：依據(jù)試劑盒要求，選擇0.230為臨界值，則0.230×2=0.460，0.230×3=0.690。質(zhì)控品的選擇以1∶256，OD值0.643,符合2～3倍臨界值(CUTT OFF，CO)范圍，因此選擇1∶256稀釋度血清作為質(zhì)控品，并分裝，0.5 ml/支，分成若干支，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 自備質(zhì)控品HIV抗體“即刻”法質(zhì)控自動(dòng)判斷表

圖1 L-J質(zhì)控圖分析判斷圖

3 討論

實(shí)驗(yàn)室制備HIV質(zhì)控品，根據(jù)抗原抗體等價(jià)結(jié)合的原則，將已確認(rèn)過的HIV陽性血清以3 000 r/min離心5～10 min，置56℃水浴滅活30 min，靜置冷卻。將已滅活的HIV陰性血清對(duì)HIV陽性血清進(jìn)行倍比稀釋至若干稀釋比，稀釋后的血清由低至高的順序編號(hào)，分別為1、2、3……10。將所有稀釋后的血清按樣本進(jìn)行試驗(yàn)，選取接近2～3倍臨界值(CUTT OFF值，CO值)的血清樣本作為外部質(zhì)控品。由于質(zhì)控品在分裝保存后效價(jià)會(huì)出現(xiàn)一定程度下降，因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇接近2～3倍CUTT OFF值。本室通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)獲得稀釋比為1∶256，OD值0.643血清樣本符合外部質(zhì)控品的要求。把1∶125的血清進(jìn)行分裝保存一周血清穩(wěn)定下來，再進(jìn)行質(zhì)控試驗(yàn)，這是室內(nèi)質(zhì)控獲得成功與穩(wěn)定的關(guān)節(jié)環(huán)節(jié)。

試劑廠家在包被微孔條時(shí)已經(jīng)固定好一定含量的HIV抗原，當(dāng)外部質(zhì)控品抗體過多時(shí)，會(huì)出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，而抗體過少時(shí)會(huì)出現(xiàn)后帶現(xiàn)象；只有在抗原抗體在等價(jià)時(shí)，試驗(yàn)效應(yīng)才是最佳結(jié)合，出現(xiàn)等價(jià)帶效應(yīng)現(xiàn)象，是試驗(yàn)預(yù)期的期望值[4]。

“即刻”法質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，須按實(shí)驗(yàn)時(shí)間順序錄入數(shù)據(jù)，不能按數(shù)據(jù)大小排列錄入，這會(huì)影響整個(gè)過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性，不符合正態(tài)分布。表1結(jié)果按此法先后錄入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，自動(dòng)判斷結(jié)果顯示為沒有出現(xiàn)警告、失控現(xiàn)象。變異系數(shù)(CV)7.67%小于10%，說明自制質(zhì)控品穩(wěn)定性好，檢測(cè)結(jié)果變異性符合質(zhì)量控制要求。然而，“即刻”法質(zhì)控只是解決實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果是否失控，不能體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件是否發(fā)生了變化，因此，需要繪制L-J氏質(zhì)控圖才能反映實(shí)驗(yàn)環(huán)境是否發(fā)生變化[5]。

L-J質(zhì)控圖是反映時(shí)間-空間發(fā)生變化時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變化，既能反映結(jié)果是否在控，又能體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性[6]。從表2可以直觀地看出，實(shí)驗(yàn)測(cè)得離散度(s/CO)值隨著時(shí)空變化沒有超出2倍標(biāo)準(zhǔn)差(±2 s)范圍，基本上呈現(xiàn)正弦式分布，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定在控。在第7～9次和第15～17次出現(xiàn)2次小的位移現(xiàn)象，s/CO值落在均值的一側(cè)(3次)，這種現(xiàn)象稱作漂移，提示實(shí)驗(yàn)環(huán)境發(fā)生了變化，但沒有出現(xiàn)5～7次趨勢(shì)現(xiàn)象，結(jié)果可接受。

綜合表1和圖1分析來看，“即刻”法和L-J質(zhì)控圖表明：自備質(zhì)控品具備穩(wěn)定性、連續(xù)性、可靠性，適合HIV抗體篩查室內(nèi)質(zhì)控活動(dòng)。

如果自備的質(zhì)控品在實(shí)驗(yàn)中若出現(xiàn)以下情況之一，應(yīng)暫停試驗(yàn)，查找原因：(1)出現(xiàn)1次超出3倍標(biāo)準(zhǔn)差(±3 s)范圍的變化；(2)連續(xù)2次出現(xiàn)同一方向超(±2 s)圍的變化；(3)連續(xù)4次出現(xiàn)同一方向超出1倍標(biāo)準(zhǔn)差(±1 s)范圍的變化；(4)連續(xù)10次結(jié)果都在(±1 s)范圍內(nèi)，但落在均值線的同一側(cè)。

出現(xiàn)漂移現(xiàn)象可能原因及糾正：(1)洗板次數(shù)，保持所有實(shí)驗(yàn)同樣洗板次數(shù)；(2)酶標(biāo)儀和移液器，定期校準(zhǔn)或檢定，上機(jī)前，應(yīng)開機(jī)30 min，保證酶標(biāo)儀照射光強(qiáng)度穩(wěn)定；(3)環(huán)境溫濕度變化及空調(diào)風(fēng)口朝向，應(yīng)控制溫濕度環(huán)境，空調(diào)開口不要對(duì)著實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，造成室內(nèi)相對(duì)溫濕度不平衡。

質(zhì)控圖若出現(xiàn)趨勢(shì)現(xiàn)象，則可能是由參數(shù)的緩慢改變引起，引起的可能因素及糾正：(1)檢測(cè)試劑，更換試劑時(shí)應(yīng)做平行試驗(yàn)；(2)質(zhì)控品，質(zhì)控品從-20℃冰柜拿出解凍后應(yīng)放置在2～8℃，一周內(nèi)用完，用不完則丟棄，不應(yīng)反復(fù)凍融，以免效價(jià)降低；(3)試劑、樣本、質(zhì)控品，應(yīng)放置室溫平衡30 min；(4)反應(yīng)時(shí)間，嚴(yán)格按照試劑盒說明書在水浴避光孵育1 h，不應(yīng)人為減少反應(yīng)時(shí)間；(5)讀取結(jié)果，應(yīng)在加終止液后10 min內(nèi)讀取結(jié)果，以免形成結(jié)晶，改變光的折射，降低OD值計(jì)算讀數(shù)；(6)加樣，槍頭應(yīng)浸入液面2～3 mm,反向加樣，保證加樣量足夠。

在實(shí)驗(yàn)活動(dòng)過程中，要制定每一年度的室內(nèi)質(zhì)控計(jì)劃并定期分析，應(yīng)用兩種質(zhì)控分析，評(píng)判我們的實(shí)驗(yàn)環(huán)境、人員、試劑、加樣過程是否穩(wěn)定，結(jié)果是否可靠，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和連續(xù)性是否得到保證。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室SOP文件開展實(shí)驗(yàn)，并積極參加省級(jí)以上組織的室間PT能力驗(yàn)證活動(dòng)，以評(píng)價(jià)中心的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)能力(IQA)，保障實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力更上一層臺(tái)階[7]。在室內(nèi)質(zhì)控分析應(yīng)用中，本中心同時(shí)作出兩種分析，既直觀又方便分析，獲得較佳的效果。