鄭 瑞，周詩晨，孫麗娜，田 瑤，王 鑫，蘭志鵬，王馨翊，楊曉穎，梁閃閃，欒維江

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

水稻從營養(yǎng)生長到生殖生長轉變是水稻生命活動中的關鍵轉折點，這個轉變的時間一般稱為開花時間（flowering time），開花過程是由植物自身基因和環(huán)境（光照和溫度等）相互作用決定的[1].影響水稻開花時間的主要環(huán)境因素是光周期，植物對光周期能夠做出規(guī)律性應答.植株體內有著復雜的光周期調控通路，其中各基因相互作用，共同決定水稻的開花時間.成花素基因（FLOWERING LOCUS T，F(xiàn)T）是植物光周期調控開花途徑中的一個關鍵基因，在多種植物中能夠促進開花[2].水稻同源的FT-like基因家族包含13個成員，即OsFTL1~OsFTL13，其中，OsFTL2（Heading date 3a，Hd3a）和OsFTL3（RICE FLOWERING LOCUS T1，RFT1）的研究較為深入[3-4].Hd3a是擬南芥FT的同源基因，其作用機理已被揭示清楚[3].Hd3a蛋白在水稻葉片中合成，經過莖韌皮部轉運到達莖頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM），2分子的Hd3a蛋白先在SAM細胞的細胞質中與2分子的14-3-3受體結合，然后進入細胞核與2分子的OsFD1蛋白結合，形成開花激活復合體（florigen activation complex，F(xiàn)AC）.之后，F(xiàn)AC結合到OsMADS15基因啟動子序列上調控基因表達，進而促進水稻開花[5].成花素蛋白屬于磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP）蛋白家族，在進化上比較保守[6].本實驗室前期構建了OsFTL12的過量表達載體，通過農桿菌介導的遺傳轉化法獲得了轉基因植株，田間觀察發(fā)現(xiàn)OsFTL12過量表達轉基因植株呈現(xiàn)晚抽穗表型[7].將FT-like基因家族成員進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育樹上，OsFTL12和OsFTL13處于同一分支，二者的氨基酸序列同一性高達66.49%，暗示二者可能具有相似的生物學功能.為了進一步研究這2個基因的功能，本研究創(chuàng)建了OsFTL12和OsFTL13基因雙突變體.

CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR-associated 9）技術是近些年發(fā)展起來的新一代基因編輯技術.該技術發(fā)揮功能的原理：CRISPR簇經過轉錄加工形成成熟的crRNA，與tracrRNA和Cas形成復合體，結合匹配到靶DNA序列并切割目標DNA鏈，生物體在進行DNA鏈斷裂修復時產生堿基插入或缺失，這種插入或缺失主要是被編輯的生物體內源DNA序列的插入或缺失[8].與鋅指核酸內切酶（zinc finger endonuclease，ZFN）和類轉錄因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）相比，CRISPR系統(tǒng)具有成本低、效率高、操作簡單等優(yōu)點[9]，因此得到迅速發(fā)展和應用，成為研究基因功能的一種工具.

本研究采用CRISPR-Cas9載體系統(tǒng)，將OsFTL12和OsFTL132個基因的靶點序列融合到CRISPR-Cas9載體中，通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化法，獲得轉基因植株.對轉基因植株進行鑒定分析，獲得OsFTL12和OsFTL13基因雙突變體，為研究OsFTL12和OsFTL13基因功能奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以粳稻品種中花11（Oryza sativaL.ssp.Japonicacv.Zhonghua11）為背景材料，獲得CRISPR-Cas9編輯材料.

1.2 CRISPR-Cas9載體構建

首先在OsFTL12和OsFTL13基因的外顯子上設計用于CRISPR-Cas9編輯的靶點.以含有啟動子和gRNA的質粒作為模板，分別加入靶點引物，通過PCR獲得各個融合有靶點的表達盒（啟動子-靶點-sgRNA）.PCR程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃充分延伸7 min.將所有靶點表達盒和CRISPR-Cas9載體用BsaI酶切，利用T4-DNA連接酶在16℃水浴條件下連接過夜，連接產物經過熱激轉化，挑取陽性單克隆搖菌后，提取質粒進行酶切鑒定，獲得同時連接3個靶點的重組載體，重組載體測序確認后備用.所設計靶點序列：FTL12-TG1為5′-GAGGCCTGTGTTTAATGGCA-3′；FTL12-TG2為5′-GCAGGTATTCCCTCAAGGTT-3′；FTL13-TG為5′-GCGTGTGATCGGAGATGTCC-3′.

1.3 轉基因植株的獲取及分子檢測

將正確的CRISPR-Cas9重組載體導入農桿菌中轉化水稻品種中花11，產生CRISPR-Cas9編輯的突變體.待植株生長健壯，收集各植株葉片，使用CTAB法提取DNA，以此作為模板，用載體中特異的潮霉素基因（Hyg）引物進行PCR擴增，PCR程序同1.2中的程序，檢測重組載體是否導入水稻中.Hyg引物序列：HygF為5′-GGAGCATATACGCCCGGAGT-3′；HygR為5′-GTTTATCGGCACTTTGCATCG-3′.

1.4 突變體植株編輯類型鑒定

為了明確編輯突變體發(fā)生了何種類型的突變，分別在OsFTL12和OsFTL13基因的靶點上下游設計檢測引物，以單株DNA為模板進行PCR擴增，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序，從而確認各編輯突變體發(fā)生的編輯類型.檢測引物序列：FTL12-TestF為5′-GCCTGTTAGCATTTGTAGAG-3′；FTL12-TestR為5′-GTCACCATCCTGTCATATTG-3′；FTL13-TestF為5′-GTCCCAACACAACACAAACC-3′；FTL13-TestR為5′-AAGTGGGTTTAGCGGGTTAG-3′.同時，在FTL12-TG1靶點上下游設計一條新的檢測引物（野生型中目標片段大小為206 bp），用于檢測發(fā)生了較大片段缺失或者插入的編輯類型.引物序列：FTL12-XF為5′-TAGTTGGAGATGTGTTAGAC-3′；FTL12-XR為5′-GACTCTTTTGGATCGGGTAT-3′.用該引物進行PCR擴增后，產物用3%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，直觀檢測在編輯突變體中發(fā)生的缺失或插入.

2 結果與分析

2.1 靶點選擇及引物設計

借助網站（http：//skl.scau.edu.cn/home/），在目標基因編碼序列中依照GC含量50%~70%、長度20 nt、含有NGG（protospacer adjacent motif，PAM）識別序列的原則篩選靶點.OsFTL12和OsFTL13均含有4個外顯子和3個內含子，如圖1所示，二者的編碼序列總長分別為522 bp和558 bp.本研究在OsFTL12基因上選擇了2個靶點，第1個靶點位于第1個外顯子，命名為FTL12-TG1，第2個靶點位于第2個外顯子，命名為FTL12-TG2；在OsFTL13基因的第1個外顯子上選擇了1個靶點，命名為FTL13-TG.將3個靶點序列分別進行Blast序列比對，結果顯示各靶點均特異.

圖1 OsFTL12和OsFTL13基因結構及靶點位置Fig.1 Gene structure and target sites position of OsFTL12 and OsFTL13

2.2 CRISPR-Cas9載體構建

將靶點同啟動子和gRNA序列融合，利用PCR擴增分別得到3個靶點表達盒，產物經過瓊脂糖凝膠電泳驗證，目標片段大小正確，如圖2（a）所示.將3個靶點表達盒同時連入CRISPR-Cas9空載體獲得重組載體，重組載體進行酶切鑒定，結果顯示切出了預期大小的目的片段，如圖2（b）所示，表明含有3個靶點的sgRNA已成功連入了目的載體中.將重組載體送往生工生物工程（上海）有限公司測序，結果顯示正確，重組載體可用于后續(xù)實驗.

注：M1為DL2000 DNA Maker；M2為DL15000 DNA Maker；P為重組載體.

2.3 轉基因植株的獲取及分子檢測

將驗證正確的CRISPR-Cas9重組載體通過電擊轉化進農桿菌感受態(tài)（EHA105）中，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法將CRISPR-Cas9重組載體導入水稻品種中花11中，共得到9株轉基因當代（T0）植株.用載體中特異的標記基因引物對獲得的轉基因植株進行PCR鑒定，結果表明有8株為轉基因陽性植株，如圖3所示.

圖3 T0代轉基因植株分子鑒定Fig.3 Identification of T0 generation of transgenic plants

2.4 突變體植株編輯類型分析

通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)獲得的突變體編輯類型多樣，為了檢測獲得的8株轉基因陽性植株是否發(fā)生了編輯，用OsFTL12和OsFTL13特異檢測引物分別擴增出包含OsFTL12和OsFTL13靶點的基因片段，對產物進行測序，結果如圖4所示.

總之，車載光伏遠程控制空調是汽車制冷發(fā)展的一個重要方向，由于其在應用上的優(yōu)點突出，在未來擁有著廣闊的應用前景。

圖4 T0代突變體的編輯類型分析Fig.4 Analysis of T0 generation of editing mutants

測序結果表明，8株轉基因陽性植株中有3株雙編輯突變體，命名為m1、m2和m3.其中，OsFTL12的突變均發(fā)生在FTL12-TG1靶點上，編輯類型有3種.m1是一個純合突變體，在PAM前3 bp處發(fā)生1 bp缺失，如圖4（a）和圖4（h）所示.m2也是一個純合突變體，在PAM前17 bp處發(fā)生19 bp缺失，經3%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，野生型中擴增出了206 bp的目的片段，而在突變體中擴增出了較小的187 bp的片段，說明該突變體的確缺失了19 bp，如圖4（b）、圖4（c）和圖4（h）所示.m3是一個大片段插入的雙等位突變體，OsFTL12基因靶點序列擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)有2個條帶，將其分別進行回收測序，結果顯示m3的一條同源染色體上在PAM前3 bp處發(fā)生1 bp缺失，該鏈用m3′表示；另一同源染色體上發(fā)生了376 bp的大片段插入，該鏈用m3″表示，如圖4（d）、圖4（e）、圖4（f）和4（h）所示.將m3″的測序序列在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）上進行Blast比對，結果表明這個大片段來自于CRISPR-Cas9載體，具體發(fā)生的編輯類型為，在PAM前3 bp處缺失10 bp水稻OsFTL12基因序列，緊接著插入376 bp的載體部分序列.用BioXM2.6將這376 bp與部分CRISPR-Cas9載體序列進行比對，結果完全一致，如圖4（j）所示.

3個突變體中，OsFTL13的編輯類型僅有一種，均在FTL13-TG靶點PAM前4 bp處純合缺失1 bp，如圖4（g）和圖4（i）所示.

2.5 突變體的氨基酸序列比對

OsFTL12基因編碼序列522 bp，編碼的蛋白質含有173個氨基酸.OsFTL13基因編碼序列558 bp，編碼的蛋白質含有185個氨基酸.用BioXM 2.6軟件將獲得的3株突變體OsFTL12和OsFTL13序列進行翻譯，結果顯示，3個突變體OsFTL12和OsFTL13基因的翻譯過程均因移碼造成提前終止，最終生成不同程度截短多肽.m1、m2、m3′和m3″的OsFTL12編碼的截短蛋白分別包含46、40和46和39個氨基酸，OsFTL13編碼的截短蛋白均包含36個氨基酸，如圖5所示.

圖5 突變體的氨基酸序列比對Fig.5 Comparison of amino acid sequence in different mutants

2.6 雙等位缺失插入突變體m3的遺傳分析及突變體植株的抽穗期統(tǒng)計

將m1、m2和m3轉基因當代植株自交產生的種子進行播種，得到OsFTL12和OsFTL13不同編輯類型的T1代植株.以T1代單株DNA為模板，用FTL12-XF和FTL12-XR引物進行靶點序列擴增.測序結果顯示，m3的T1代植株靶點序列得到分離，種植的29個單株中，純合10 bp缺失和大片段插入的有10株，即圖6（a）中的2、4、5、7、8、11、14、18、21和29；純合1 bp缺失的有6株，即圖6（a）中的12、15、17、19、24和28；雙等位編輯的13株，即圖6（a）中的1、3、6、9、10、13、16、20、22、23、25、26和27.說明突變類型能穩(wěn)定遺傳，可以用于基因功能分析.

經過測序確定各單株的編輯類型，統(tǒng)計OsFTL12和OsFTL13發(fā)生編輯單株的抽穗期，同野生型進行比較，結果如圖6（b）所示.由圖6（b）可以看出，與野生型相比，m1和m2抽穗期未發(fā)生顯著性變化，m3的抽穗期提前了1.7 d.

圖6 T1代m3突變體的遺傳分析及突變體植株的抽穗期統(tǒng)計Fig.6 Inheritance analysis of m3 mutants and statistics of heading date of mutants in T1 generation

3 討論與結論

本研究利用CRISPR-Cas9編輯技術創(chuàng)建了水稻OsFTL12及OsFTL13基因的雙突變體，并對突變體的編輯類型進行分析.產生的雙突變體中，OsFTL12基因發(fā)生了3種類型的編輯，分別為純合1 bp缺失、純合19 bp缺失和雙等位突變.尤其是在雙等位突變體中發(fā)生了鮮見的CRISPR-Cas9載體序列插入的編輯類型.OsFTL13基因僅有一種類型的編輯，即1 bp缺失.這些雙突變體的創(chuàng)建為全面研究水稻成花素家族基因功能奠定了材料基礎，尤其新編輯類型的產生拓展了人們對CRISPR-Cas9編輯類型的認識.

雖然CRISPR-Cas9編輯技術簡單有效，但在實際應用中存在較大風險，如脫靶（off-target）的可能[11].可以通過一些軟件進行脫靶效應評估[12]，也可以進行全基因組測序來確定脫靶位點.通過各種改良措施來降低脫靶率一直是研究熱點，然而目前脫靶現(xiàn)象仍不可避免，這種脫靶的風險主要是由于CRISPR-Cas9編輯類型豐富復雜.通常CRISPR-Cas9編輯可能會產生所編輯基因的序列插入、缺失和替換[13]，很少發(fā)生載體片段的插入類型.在本研究中，創(chuàng)建CRISPR-Cas9編輯突變體的過程中意外得到了一株插入CRISPR-Cas9載體片段（376 bp）的突變體，并且該突變體可以穩(wěn)定遺傳到后代，表明了CRISPR-Cas9編輯類型的復雜性及多樣性.將靶點序列與插入的CRISPR-Cas9載體序列進行比對，發(fā)現(xiàn)二者沒有同源性，說明新型插入突變體應該不是通過同源重組產生的.這也意味著這株特殊突變體很有可能是由錯誤切割導致的：CRISPR載體在進行基因組目標序列切割時，也切下了自身的一段序列，被切斷的基因組在修復過程中，錯誤引入了這一大片段載體序列.事實上，靶序列可能在匹配目標基因組時發(fā)生錯誤結合，從而導致錯誤切割基因組.Zuccaro等[14]在嘗試利用CRISPR-Cas9技術糾正人胚胎EYS位點突變導致的致盲性狀的過程中，發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9編輯導致頻繁的染色體丟失.本研究中特殊突變體的獲得也暗示了CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯的復雜性和不可控性，它不僅可能會切割與靶點序列完全匹配的基因序列，也會對匹配度不高的序列進行切割.這種不可控性嚴重限制了其在基因治療中的應用和發(fā)展.