張利琴 殷紅燕 張 波 楊 健 李 燕

(1.泰安市林業(yè)保護(hù)發(fā)展中心，山東泰安 271000；2.濟(jì)南協(xié)和雙語實(shí)驗(yàn)學(xué)校，山東濟(jì)南 250107)

桑樹是家蠶的飼料樹種，也是沙漠化治理、水土保持、鹽堿地治理的重要生態(tài)樹種，培育桑樹抗鹽品種，不僅有利于鹽堿地的治理，而且對(duì)于桑樹生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的實(shí)現(xiàn)也具有重要意義。γ-氨基丁酸(GABA)是一種四碳非蛋白氨基酸，是植物抵抗逆境脅迫的主要代謝產(chǎn)物，在逆境脅迫下在植物體內(nèi)大量積累，提高植物對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力[1]。在植物體內(nèi)，GABA能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH、清除自由基、參與植物體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)逆境脅迫響應(yīng)等[2]。GABA是除脯氨酸外，植物細(xì)胞內(nèi)含量隨環(huán)境鹽濃度改變變化最大的氨基酸，也是從鹽脅迫開始含量就顯著增加的游離氨基酸[3]。有研究表明，施加外源GABA能夠緩解鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)過程中胚根的伸長和胚芽生長的抑制作用[4]，能提高植物體內(nèi)谷氨酸脫羧酶(GAD)活性及氨基酸含量，減輕鹽脅迫下葉片受活性氧(ROS)累積所導(dǎo)致的氧化損傷程度，增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的抗性[5-6]。為探究γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)桑樹耐鹽能力的影響，對(duì)NaCl脅迫處理下的桑樹幼苗施用外源GABA，以期為桑樹抗鹽育種提供新種質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 鹽脅迫下桑樹幼苗生長實(shí)驗(yàn)

前期準(zhǔn)備：桂桑優(yōu)62號(hào)桑樹種子，要求籽粒大小一致、完整飽滿。待種子萌發(fā)后，選取長勢(shì)一致的桑樹幼苗移栽到裝有等量蛭石的花盆中，每盆1株，共培育12盆，放入長日照(D/N 16 h/8 h)人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

幼苗脅迫處理：幼苗生長兩個(gè)月后，選取長勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行控水，分別向托盤中澆灌等量清水、2 g·L-1、4 g·L-1、6 g·L-1、8 g·L-1及10 g·L-1的NaCl溶液，每天觀察幼苗生長情況并記錄，待幼苗出現(xiàn)明顯脅迫表型時(shí)，拍照記錄植株生長情況并測(cè)量植株株高、地上地下部分生物量各項(xiàng)指標(biāo)，測(cè)量方法如下：

株高：測(cè)量植株根基部至主莖頂部(主莖生長點(diǎn))之間的距離。

植株鮮重與干重：將植株分為地上部分與地下部分，用去離子水將植物材料沖洗干凈，吸干植株表面水分，測(cè)量鮮重。再將植物材料放在105 ℃烘箱中烘干至恒重，測(cè)量干重。

1.2 鹽脅迫下外源GABA處理試驗(yàn)

選取苗齡2個(gè)月長勢(shì)一致的桂桑優(yōu)62號(hào)桑樹幼苗，設(shè)置四個(gè)處理組，每組3個(gè)重復(fù)，控水完全后進(jìn)行以下處理：澆灌清水與葉片噴施清水；澆灌清水與葉片噴施50 mmol·L-1GABA；澆灌10 g·L-1NaCl與葉片噴施清水；澆灌10 g·L-1NaCl 與葉片噴施50 mmol·L-1GABA。

1.3 超氧陰離子自由基(O2-·)的測(cè)定

1)植物材料的準(zhǔn)備：挑選成熟飽滿，大小均勻的桂桑優(yōu)62號(hào)種子，平鋪于GM(100 mL去離子水中加入1 g蔗糖、1.3 g瓊脂及0.237 g MS)培養(yǎng)板上，用封口膜密封完全，放入長日照人工氣候培養(yǎng)箱中生長，待子葉完全展開，對(duì)幼苗進(jìn)行NaCl處理；

2)將幼苗根部從培養(yǎng)基中分離，分別向培養(yǎng)皿中加入清水和10 g·L-1NaCl溶液，將幼苗根部浸沒，根據(jù)已有的研究[7]，設(shè)置兩個(gè)處理組，分別用1 mmol·L-1和10 mmol·L-1GABA正反面噴施NaCl處理的幼苗葉片，放入人工氣候培養(yǎng)箱中處理0 h、6 h及12 h。清水處理作為空白對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，處理完成后用液氮將材料速凍并放入﹣80 ℃保存。處理方法如表1所示：

表1 桑樹幼苗處理方法

3)配制NBT染色液：A液：Na2HPO4，B液：NaH2PO4，先將A液置于燒杯中，用B液調(diào)pH 7.6，配制成pH 7.6的10 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液，每100 mL磷酸鈉緩沖液中加入50 mg NBT，配制完成后避光保存；

4)染色：將植物材料置于25 mL離心管中，加入20 mL染色液，室溫下黑暗染色12 h，染色完成后，倒掉染色液，加入20 mL 95%乙醇，在100 ℃沸水浴中至組織完全脫色，拍照觀察。

1.4 過氧化氫(H2O2)的測(cè)定

植物材料的處理方法同2.3一致。稱取一定量的3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶于pH 3.8的無菌ddH2O中，配制成1 mg·mL-1的DAB染色液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，將NaCl處理的桑苗放入50 mL離心管中，加入30 mL DAB染色液，室溫黑暗環(huán)境下染色12～16 h，染色完成后，倒掉染色液，加入30 mL 95%乙醇，在100 ℃沸水浴中至組織完全脫色，拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GABA對(duì)桑樹幼苗耐鹽性的影響

為探討外源GABA是否影響桑樹幼苗的耐鹽性，本研究對(duì)鹽分脅迫下的桑樹幼苗施用外源GABA，發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下，與噴施清水處理(對(duì)照)相比，噴施50 mmol·L-1外源GABA對(duì)桑樹幼苗的生長沒有顯著影響。但在10‰NaCl脅迫條件下，沒有噴施50 mmol·L-1外源GABA的桑樹幼苗植株矮小、葉片萎蔫，鹽害癥狀明顯，而施加50 mmol·L-1外源GABA的桑樹幼苗鹽害癥狀明顯減輕。因此，在鹽分脅迫條件下，外源GABA能明顯緩解鹽脅迫對(duì)幼苗生長的危害(圖3-1)。

圖2-1 外源GABA對(duì)NaCl脅迫下桂桑優(yōu)62號(hào)幼苗生長的影響

2.2 外源GABA對(duì)NaCl脅迫下桑樹幼苗中O2-·和H2O2含量的影響

采用NBT顯色法測(cè)定了NaCl脅迫下桑樹幼苗根系中O2-·含量(圖2-2)，圖中藍(lán)色沉淀代表O2-·積累量，藍(lán)色越深代表O2-·積累量越多。由圖可知，在對(duì)照組幼苗的根中幾乎檢測(cè)到不到藍(lán)色沉淀，而在NaCl處理組植株的根系中O2-·積累量隨NaCl處理時(shí)間的增加而增多，并且NaCl濃度越高，根中O2-·積累量越大。但是，施用外源GABA可以明顯減少脅迫處理?xiàng)l件下植株根中O2-·的積累量，并且施用的GABA濃度越大，根系中O2-·積累量越少。因此，施用外源GABA可以減少鹽分脅迫下植物根中O2-·的積累。

圖2-2 NBT溶液染色法檢測(cè)桑苗根系中O2-·含量

同時(shí)，我們采用DAB顯色法測(cè)定了桑樹幼苗葉片中H2O2的積累量(圖2-3)，圖中棕色沉淀代表葉片中H2O2的積累量，棕色越深代表H2O2積累量越多。由圖可知，在正常生長條件下桑樹幼苗葉片經(jīng)DAB染色，幾乎檢測(cè)不到棕色沉淀，表明H2O2的積累量極低。但NaCl脅迫處理6 h后葉片呈現(xiàn)明顯的棕褐色，表明葉片中已有大量H2O2積累，脅迫處理12 h后，葉片棕褐色更加明顯，表明葉片中H2O2積累顯著增加。由圖可以看出在鹽分脅迫下對(duì)桑樹幼苗施加外源GABA可以顯著降低葉片中H2O2積累，并且施加的外源GABA濃度越大，葉片中H2O2積累量越少。因此，施用外源GABA可以減少鹽分脅迫下桑樹葉片中H2O2的積累。

圖2-3 DAB溶液染色法檢測(cè)桑苗葉片中H2O2含量

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，施加外源GABA可調(diào)控NaCl脅迫下植物體內(nèi)的活性氧代謝，降低O2-·的產(chǎn)生速率，緩解ROS過量積累對(duì)細(xì)胞造成的氧化脅迫，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保護(hù)葉綠體膜結(jié)構(gòu)的完整性，維持植物正常生長發(fā)育[8]。我們的研究結(jié)果也表明外源GABA緩解了NaCl脅迫對(duì)桂桑優(yōu)62號(hào)幼苗的危害，減少了植物體內(nèi)O2-·和H2O2的積累量。但也有研究表明GABA含量與植物的耐鹽性并不直接相關(guān)。Bao等[9]發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理會(huì)破壞番茄植株體內(nèi)正常的GABA代謝，影響下游產(chǎn)物琥珀酸半醛(SSA)的代謝平衡，從而減少琥珀酸對(duì)TCA循環(huán)的補(bǔ)充。敲除番茄的SlGADs基因降低了番茄細(xì)胞內(nèi)GABA濃度，而敲除SlGABA-Ts基因，則會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)的GABA濃度，但兩者都降低了番茄幼苗的耐鹽性。對(duì)鹽脅迫下的擬南芥研究也發(fā)現(xiàn)，GABA分解過程的破壞也會(huì)導(dǎo)致植物耐鹽性下降，表明GABA分解代謝是影響擬南芥耐鹽性的關(guān)鍵[10]。因此，GABA含量與耐鹽性并不直接相關(guān)，GABA分流支路可能才是影響植物抗逆性的關(guān)鍵[11-12]，此研究結(jié)果，在擬南芥和桑樹毛狀根中過表達(dá)GABA-T基因，降低了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的抗性，但噴施外源GABA則可以緩解鹽分脅迫的危害。這表明，盡管在轉(zhuǎn)基因植株中GABA分解代謝過程得到加強(qiáng)，但是由于鹽分脅迫下轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的GABA合成速度與野生型植株相比并未提高，因此，并不能為TCA循環(huán)提供更多的物質(zhì)補(bǔ)充，也不能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。但是，在擬南芥和桑樹毛狀根中過表達(dá)GAD則可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)GABA的合成，進(jìn)而會(huì)促進(jìn)GABA分解代謝過程，為TCA循環(huán)提供更多的物質(zhì)補(bǔ)充，提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。

有研究表明，GABA除了作為氮代謝的中間產(chǎn)物，在維持碳氮平衡中發(fā)揮重要作用外，GABA還具有較強(qiáng)的親水能力及滲透調(diào)節(jié)能力，在逆境脅迫下具有與脯氨酸相似的功能，起到滲透調(diào)節(jié)作用[13]。鹽分脅迫下，GABA能降低細(xì)胞質(zhì)水勢(shì)，減少細(xì)胞失水，緩解細(xì)胞因失水過多而產(chǎn)生的傷害[14]。我們的試驗(yàn)結(jié)果也表明施用外源GABA可以緩解NaCl脅迫對(duì)桑樹和擬南芥的危害，這些外源的GABA可能會(huì)促進(jìn)GABA分解代謝過程，為TCA循環(huán)提供更多的物質(zhì)補(bǔ)充，也可能提高了植物細(xì)胞的滲透壓，增強(qiáng)的植物細(xì)胞的吸水能力和持水能力，提高植物的耐鹽性。在擬南芥和桑樹毛狀根中過表達(dá)GAD基因可能會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)GABA的合成，為TCA循環(huán)提供更多的物質(zhì)補(bǔ)充，也可能是提高了細(xì)胞內(nèi)GABA的含量，增加了植物細(xì)胞的滲透壓，從而提高植物的耐鹽性，但具體的作用機(jī)制目前還不清楚。另外，還有研究認(rèn)為，GABA還可能參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物響應(yīng)逆境脅迫方面具有重要作用[15]。因此，GABA對(duì)植物耐鹽性的影響可能具有多種調(diào)控機(jī)制。通過對(duì)Mul-GAD基因啟動(dòng)子的活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其除了具有NaCl脅迫誘導(dǎo)活性外，其還具有光照、ABA、SA和MEJA等多種誘導(dǎo)活性。這一方面表明Mul-GAD基因的表達(dá)受多種因素調(diào)控，也說明GABA可能參與植物體內(nèi)多種調(diào)控途徑。通過對(duì)Mul-GABA-T和Mul-GAD基因的組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，盡管兩個(gè)基因都不具有組織表達(dá)特異性，但兩個(gè)基因在不同組織中的表達(dá)模式并不相同。因此，兩個(gè)基因可能具有不同的調(diào)控機(jī)制。綜上所述，不僅GABA的代謝具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，其對(duì)于植物耐鹽性的影響也具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。深入研究GABA的耐鹽調(diào)控機(jī)制及其代謝途徑相關(guān)基因在植物鹽分脅迫響應(yīng)過程中的作用，有助于發(fā)掘新的耐鹽基因，全面解析植物的耐鹽機(jī)制。