王梓丞，楊 碩，關(guān) 旸，2，劉保東，2

（1. 哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150025；2. 黑龍江普通高等學(xué)校植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150025）

對開蕨(Phyllitis japonicaKom.)屬鐵角蕨科(Aspleniaceae)，主要分布于我國吉林省長白山南麓和西部地區(qū)，具有較高的觀賞價值[1?2]，是東北地區(qū)稀有的四季常綠蕨類植物，有成為城市特色綠化植物的前景[3?4]，但由于生境被破壞，野生資源逐漸瀕危，我國于1999年正式批準(zhǔn)對開蕨為國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物。最新研究表明，對開蕨種群較小且不穩(wěn)定，自然繁殖能力較弱，幼苗處于衰退階段[5?6]。有學(xué)者研究表明，蕨類種群幼苗減少與環(huán)境污染有關(guān)[7?8]，環(huán)境污染會破壞植物的生殖能力，還會擾亂植物的生理生化過程，對植物造成傷害[9?11]。因此，環(huán)境污染可能是對開蕨種群幼苗減少的原因之一。

重金屬污染已經(jīng)成為我國城市的主要環(huán)境問題之一，其中Cd 和Pb 是城市主要的污染物。Cd 和Pb 是植物非必需元素，若在土壤中含量過高，會對植物產(chǎn)生不利影響[12?14]。配子體是蕨類植物有性生殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，較孢子體與成株更易受到環(huán)境污染的影響。盡管對對開蕨配子體的研究已取得了許多成果，但多是在不同培養(yǎng)條件下對孢子繁殖、配子體發(fā)育[15?16]的觀察研究，或?qū)︽咦芋w生活史[17]及環(huán)境適應(yīng)性方面的研究[18?20]，且都是在非脅迫條件下完成的，而脅迫條件下對開蕨配子體發(fā)育的相關(guān)研究少見報道。雖然肖湘等[8]、汪盛等[21]對重金屬脅迫下桫欏配子體發(fā)育進(jìn)行了研究，但蕨類植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活習(xí)性皆不相同，這意味著其系統(tǒng)發(fā)育和生殖結(jié)構(gòu)有著很大差異。因此，闡明對開蕨配子體在逆境脅迫下的發(fā)育情況，既是對蕨類生殖生物學(xué)的補(bǔ)充，也可為對開蕨成為城市特色綠化植物提供基礎(chǔ)資料。

鑒于此，以對開蕨配子體為材料，分別以2種常見重金屬污染物Cd2+、Pb2+進(jìn)行單一脅迫，觀察對開蕨配子體發(fā)育的變化，旨在探討對開蕨幼苗減少與重金屬污染之間的聯(lián)系，進(jìn)一步探索對開蕨配子體對Pb、Cd的耐受性，為對開蕨保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

對開蕨孢子于2016 年采自長白山，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，憑證標(biāo)本現(xiàn)存于哈爾濱師范大學(xué)標(biāo)本館。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)于2020 年9 月在哈爾濱師范大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，土壤處理參考紀(jì)善博[7]的方法。取42 個透明、容積為1 L 的方形塑料容器，向其中分別加入300 g土（以干土計），均分為7個處理，每個處理6次重復(fù)。根據(jù)含水量的設(shè)計，向?qū)φ眨–K）加入一定體積的水，使土壤含水量達(dá)到35%；3 個Cd2+處理分別加入一定體積、不同濃度的CdCl2溶液，使土壤中Cd2+含量分別達(dá)到0.2、0.4、0.8 mg/kg，土壤含水量為35%；3 個Pb2+處理分別加入一定體積Pb（NO3）2溶液，使土壤中Pb2+含量分別達(dá)到20、40、80 mg/kg，土壤含水量為35%。在以上7個處理土壤中播種對開蕨孢子，孢子播種方法同檀龍顏等[22]。

播種后置于培養(yǎng)室內(nèi)，光照時間12 h/d。播種后按時澆水，使土壤含水量保持在33%～36%。播種25 d 后，每3 d 觀察各組配子體長勢情況，40 d 后用Olympus 的SZX2-FOF 和BX53 顯微鏡進(jìn)行隨機(jī)鏡檢，配子體成熟后拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

時間數(shù)值以孢子播種后第一次觀察到出現(xiàn)性狀為準(zhǔn)。統(tǒng)計方法采用樣方法，在塑料容器中均勻取9 個3 cm × 3 cm 的樣方，在顯微鏡下統(tǒng)計，重復(fù)10次。數(shù)據(jù)采用Excel和R語言進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+、Pb2+脅迫對對開蕨配子體發(fā)育的影響

由表1 可知，Cd2+、Pb2+對對開蕨心形原葉體、頸卵器的形成時間以及精子器、頸卵器、假根、毛狀體的數(shù)目影響顯著，但對精子器形成時間影響不顯著。0.2 mg/kg Cd2+處理下，精子器數(shù)目增加，但與CK 差異不顯著；而頸卵器、假根、毛狀體的數(shù)目均呈下降趨勢，頸卵器、假根的數(shù)目與CK 差異顯著，毛狀體數(shù)目與CK 差異不顯著。隨著Cd2+含量進(jìn)一步升高，精子器、頸卵器、假根、毛狀體的數(shù)目顯著下降，0.8 mg/kg Cd2+處理分別較CK 下降61.5%、65.1%、73.7%、58.0%。隨著Pb2+含量升高，精子器、頸卵器、假根、毛狀體的數(shù)目顯著下降，80 mg/kg Pb2+處理分別較CK 顯著下降56.5%、65.8%、35.9%、52.8%。

表1 Cd2+、Pb2+脅迫對對開蕨配子體發(fā)育的影響Tab.1 Effects of Pb2+and Cd2+on the development of Phyllitis japonica gametophyte

2.2 Cd2+、Pb2+脅迫對對開蕨配子體葉綠體結(jié)構(gòu)的影響

正常對開蕨配子體葉綠體呈綠色，排列均勻（圖1a）；0.2 mg/kg Cd2+脅迫下，葉綠體結(jié)構(gòu)變化較?。▓D1b）；0.4 mg/kg Cd2+處理下，葉綠體邊緣出現(xiàn)黃化現(xiàn)象（圖1c）；0.8 mg/kg Cd2+處理下出現(xiàn)葉綠體融合現(xiàn)象（圖1d）。

20 mg/kg Pb2+處理下葉綠體結(jié)構(gòu)變化較?。▓D1e），40 mg/kg Pb2+脅迫下，葉綠體出現(xiàn)黃化（圖1f），或伴有細(xì)胞溶解（圖1g）；80 mg/kg Pb2+處理下，細(xì)胞黃化、溶解現(xiàn)象增加（圖1h）。

2.3 Cd2+、Pb2+脅迫對對開蕨配子體精子器的影響

對開蕨精子器為無色透明狀的圓球形，發(fā)育初期可見精子器內(nèi)產(chǎn)生精母細(xì)胞（圖2a）；在0.2 mg/kg Cd2+脅迫下，部分精子器外觀無明顯變化，精子仍可以自由釋放，但部分精子器釋放緩慢（圖2b）；0.4 mg/kg Cd2+處理下，精子器細(xì)胞壁出現(xiàn)破損現(xiàn)象，釋放的精細(xì)胞也呈現(xiàn)黃色（圖2c）；0.8 mg/kg Cd2+處理下多數(shù)精子器精子無法自由釋放，并伴有黃斑出現(xiàn)（圖2d），導(dǎo)致其失去精子器的功能。

20 mg/kg Pb2+處理下，對開蕨配子體的精子器出現(xiàn)破損情況（圖2e）；40 mg/kg Pb2+處理下精子器細(xì)胞壁出現(xiàn)黃化現(xiàn)象（圖2f）；80 mg/kg Pb2+處理下，精子器黃化現(xiàn)象更明顯（圖2g、h），但無Cd2+脅迫下精子器黃斑現(xiàn)象的發(fā)生。

2.4 Cd2+、Pb2+脅迫對對開蕨配子體頸卵器的影響

對開蕨頸卵器正常情況下呈淡綠色，含有少量葉綠體，成熟頸部是由4 列細(xì)胞組成（圖3a）；0.2 mg/kg Cd2+處理下，部分頸卵器頂端到底部顏色逐漸發(fā)黃（圖3b）；0.4 mg/kg Cd2+處理下，頸卵器頸溝發(fā)黃壞死，底部出現(xiàn)黑色異物（圖3c）；0.8 mg/kg Cd2+處理下，頸卵器壞死現(xiàn)象明顯，可能導(dǎo)致頸卵器無法正常打開，使其受精失?。▓D3d）。

20 mg/kg Pb2+處理下，頸卵器底部出現(xiàn)黃化現(xiàn)象（圖3e）；40 mg/kg Pb2+處理下，部分頸卵器底部出現(xiàn)黑色異物（圖3f），頸卵器從底部向頂端逐漸變黃（圖3g）；80 mg/kg Pb2+處理下頸卵器出現(xiàn)破損、壞死現(xiàn)象（圖3h）。

2.5 Cd2+、Pb2+脅迫對對開蕨配子體假根的影響

對開蕨假根正常呈現(xiàn)筆直或略有彎曲的管狀（圖4a）；0.2 mg/kg Cd2+處理對假根影響不明顯（圖4b）；0.4 mg/kg Cd2+處理下，出現(xiàn)假根彎曲現(xiàn)象（圖4c）；0.8 mg/kg Cd2+處理下假根出現(xiàn)褐變、彎曲的現(xiàn)象（圖4d）。

20 mg/kg Pb2+處理下，假根出現(xiàn)短小現(xiàn)象（圖4e）；40 mg/kg Pb2+處理下，出現(xiàn)區(qū)域性褐變（圖4f）；80 mg/kg Pb2+處理下，假根出現(xiàn)彎曲、滲漏與褐變現(xiàn)象（圖4 g、h）。

3 結(jié)論與討論

葉綠體是植物生長發(fā)育的重要組成部分，重金屬通過破壞植物葉綠體結(jié)構(gòu)以及抑制相關(guān)酶的活性影響植物的光合作用[23?24]。本研究結(jié)果表明，對開蕨配子體在Cd2+、Pb2+脅迫下，葉綠體有黃化現(xiàn)象發(fā)生，隨重金屬脅迫程度升高，配子體葉綠體邊緣黃化、融合現(xiàn)象增加，并伴有壞死等現(xiàn)象。這可能是由于植物葉綠體受到重金屬脅迫時，內(nèi)部產(chǎn)生大量活性氧及過氧化物，使葉綠體內(nèi)部系統(tǒng)紊亂，進(jìn)而對結(jié)構(gòu)造成破壞[25]。

精卵結(jié)合是蕨類植物有性生殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，最新研究結(jié)果表明，重金屬會使桫欏類植物的精子器及精卵器形態(tài)發(fā)生畸變，并且畸變比率與脅迫濃度呈正相關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cd2+脅迫下，多數(shù)精子器精子無法自由釋放，偶有黃斑出現(xiàn)，紀(jì)善博[7]在研究中也發(fā)現(xiàn)，在Cd2+脅迫下，中華桫欏配子體的頸卵器有黃斑現(xiàn)象，而在Pb2+脅迫下，精子器無黃斑現(xiàn)象。在Cd2+、Pb2+脅迫下，頸卵器底部均出現(xiàn)黑色異物，在Cd2+脅迫下，頸卵器從頂端到底部逐漸變黃，而在Pb2+脅迫下，部分頸卵器從底部向頂端逐漸變黃，說明不同重金屬對同種植物生殖系統(tǒng)的破壞機(jī)制也不盡相同。精子器發(fā)生變化后，可能改變精子位移和自轉(zhuǎn)頻率等，導(dǎo)致精子不能夠進(jìn)入頸卵器完成受精[11]。而頸卵器頸溝發(fā)黃壞死，導(dǎo)致頸卵器無法正常打開，不能正常接收精子，最終導(dǎo)致精卵結(jié)合失敗。

假根是蕨類配子體吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官[8]，對配子體的生長發(fā)育有著重要作用。研究表明，重金屬會對植物根系的形態(tài)產(chǎn)生影響[26?27]，同時也對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生影響[28]。本研究表明，Cd2+、Pb2+脅迫下，對開蕨配子體假根產(chǎn)生了不同程度的畸變，這可能是由于根部為了適應(yīng)環(huán)境所產(chǎn)生的變化[29]。對對開蕨配子體假根、毛狀體、精子器與頸卵器數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在高含量Cd2+、Pb2+脅迫下，精子器數(shù)、頸卵器數(shù)、假根數(shù)、毛狀體數(shù)量明顯下降，與對照差異顯著。因此推測，可能是由于假根發(fā)生畸變，導(dǎo)致配子體吸收、運(yùn)輸?shù)饶芰ψ內(nèi)酰罱K配子體發(fā)育受阻。

本研究表明，對開蕨配子體在受到重金屬脅迫時，其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化與重金屬含量有著密切聯(lián)系，說明對開蕨配子體對污染較為敏感。相比于成株，對開蕨配子體抗性較弱，不適宜種植在重金屬含量較高的土壤中。若對開蕨配子體的葉綠體出現(xiàn)發(fā)黃、精子器出現(xiàn)黃斑等特殊現(xiàn)象，說明土壤可能受到重金屬污染。本研究設(shè)置的Cd2+、Pb2+含量較低，對其他種子植物尚不能造成明顯傷害，而對于自然繁殖能力脆弱的對開蕨而言，已經(jīng)對配子體發(fā)育造成嚴(yán)重的傷害，并可能影響其正常的精卵結(jié)合，嚴(yán)重時可能會導(dǎo)致植物死亡[30?31]。