王 夢(mèng)，周香菊，聶嘉文，彭大勇，陳繼光，張清峰，唐道邦，劉 佳，尹忠平,

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省農(nóng)產(chǎn)品加工與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）

氟蟲(chóng)腈（fipronil），又名銳勁特，是羅納-普朗克公司（Rhone-Poulenc，法國(guó)）于1987年研制的一種新型含氯、氟的苯基吡唑類(lèi)殺蟲(chóng)劑[1]。該物質(zhì)于1993年作為殺蟲(chóng)劑投入到市場(chǎng)中，我國(guó)于1994年開(kāi)始將其應(yīng)用于蟲(chóng)害防治，由于殺蟲(chóng)效果好、使用劑量低、有效作用時(shí)間長(zhǎng)，曾在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛地使用，但其自然降解較慢，可通過(guò)食物鏈富集，且其對(duì)人體有較強(qiáng)的毒性，因此對(duì)人類(lèi)健康和安全有較大的危害[2?4]。氟蟲(chóng)腈可轉(zhuǎn)化生成其他化合物[5]，如厭氧條件下可轉(zhuǎn)化為氟蟲(chóng)腈亞砜（fipronil sulfide）[6]，而氟蟲(chóng)腈亞砜又可光解成氟甲腈，進(jìn)而氧化形成氟蟲(chóng)腈砜[7]。氟蟲(chóng)腈亞砜與氟蟲(chóng)腈均具有較強(qiáng)的毒性，其毒性甚至高于其母體氟蟲(chóng)腈[8?10]，研究表明，氟蟲(chóng)腈亞砜經(jīng)代謝可分布于體內(nèi)不同組織和器官中，存留時(shí)間較長(zhǎng)，可蓄積產(chǎn)生毒性作用[11?13]。因此，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中氟蟲(chóng)腈亞砜殘留進(jìn)行檢測(cè)和控制是非常有必要的。

目前在研究或使用的氟蟲(chóng)腈亞砜檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）以及高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）等。龔震等[14]采用固相萃取-高效液相色譜法對(duì)雞蛋中殘留的氟蟲(chóng)腈亞砜進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示檢出限和定量限分別為60、200 μg/kg；戴盡波等[15]建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS /MS）檢測(cè)禽源性食品中氟蟲(chóng)腈亞砜的方法，其檢測(cè)限在0.1~0.2 μg/kg之間，定量限為0.5 μg/kg。吳潔珊等[16]建立了氣相色譜快速測(cè)定氟蟲(chóng)腈亞砜殘留量的分析方法，其檢出限和定量限分別為0.2和0.5 μg/kg；高霞等[17]的報(bào)道表明，氣相色譜-負(fù)化學(xué)源電離-質(zhì)譜法（GC-NCI/MS）測(cè)定蔬菜中氟蟲(chóng)腈亞砜殘留量的檢測(cè)限在0.2~0.3 μg/kg之間，定量限為1.0 μg/kg。從目前的氟蟲(chóng)腈亞砜檢測(cè)研究報(bào)道來(lái)看，HPLC法操作簡(jiǎn)單易行，但無(wú)法滿(mǎn)足痕量檢測(cè)的要求；HPLC-MS法雖然具有較高的靈敏度和較低檢測(cè)限，但需要高端精密的儀器設(shè)備，成本較高；GC法有一定的靈敏度，但不適用沸點(diǎn)高、遇熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，應(yīng)用范圍受限；GC-MS檢測(cè)雖然所需樣品少且快速，但也需要貴重設(shè)備，干擾也較多，同時(shí)檢測(cè)范圍也受限。因此，探索高靈敏度、低成本、簡(jiǎn)便快速的氟蟲(chóng)腈亞砜痕量檢測(cè)方法是很有必要的，對(duì)氟蟲(chóng)腈亞砜殘留檢測(cè)與控制有重要意義。

高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法（HPLC-FLD）靈敏度較高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，是目前研究和應(yīng)用的重要痕量檢測(cè)方法。趙文晉等[18]建立了一種測(cè)定水樣中苯胺的HPLC-FLD檢測(cè)法，檢出限可達(dá)0.022 μg/L，定量限為0.073 μg/L。目前尚未見(jiàn)關(guān)于氟蟲(chóng)腈亞砜HPLCFLD檢測(cè)方法方面的研究報(bào)道。本文基于實(shí)驗(yàn)室前期合成的、結(jié)構(gòu)新穎的、高熒光強(qiáng)度的咔唑類(lèi)熒光衍生試劑L2，建立了氟蟲(chóng)腈亞砜柱前熒光衍生HPLCFLD檢測(cè)方法，以期為雞蛋中氟蟲(chóng)腈亞砜殘留痕量檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氟蟲(chóng)腈亞砜（HPLC≥98%） 本實(shí)驗(yàn)室合成；熒光衍生試劑L2（HPLC≥98%） 本實(shí)驗(yàn)室合成；二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、氯化鈉和無(wú)水硫酸鈉 分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、4-二甲氨基吡啶和N,N-二環(huán)己基碳酰亞胺（DCC） 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司采購(gòu)；乙腈 色譜純，美國(guó)Tieda試劑有限公司；三乙胺（TEA）和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP） 分析純，西寶生物科技（上海）股份有限公司；四氫呋喃 化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜（純度為99%） 上海索來(lái)寶科技有限公司；雞蛋樣品市購(gòu)。

DEAAXO4033高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）、GC-MS5975C質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；400/500MHZ Advance核磁共振波譜儀 布魯克科技有限公司；MR Hei-End恒溫加熱磁力攪拌器 德國(guó)海道夫集團(tuán)；FSH-2A高速勻漿機(jī) 金壇區(qū)西城新瑞儀器廠(chǎng)；TD4低速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HZQ-2冷凍恒溫振蕩器 金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；Precision MLG3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)海道夫集團(tuán)；超純水制備儀 美國(guó)Milli-Q科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氟蟲(chóng)腈亞砜柱前熒光衍生化方法

1.2.1.1 柱前熒光衍生化反應(yīng)的原理和操作步驟反應(yīng)原理：熒光衍生試劑L2的羧基與氟蟲(chóng)腈亞砜的氨基之間進(jìn)行脫水縮合，經(jīng)酰胺化反應(yīng)后生成熒光衍生化產(chǎn)物DX1，反應(yīng)如圖1所示。具體操作步驟如下：向2 mL安瓿瓶中依次加入600 μL二氯甲烷（DCM）、200 μL濃度為0.1 mol/L的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、200 μL濃度為0.2 mol/L的4-二甲氨基吡啶（DMAP）、50 μL濃度為1.0×10?3mol/L的氟蟲(chóng)腈亞砜和800 μL濃度為5.0×10?4mol/L的熒光衍生試劑L2，以上溶液均用乙腈溶解，密封；充分混勻后置于45 ℃水浴中振蕩反應(yīng)75 min；隨后取出冷卻至室溫，乙腈定容至10 mL；取樣進(jìn)行HPLC-FLD檢測(cè)。

圖1 氟蟲(chóng)腈亞砜與熒光衍生試劑L2柱前衍生化反應(yīng)方程式Fig.1 Reaction equation of precolumn fluorescence derivatization reaction between L2 and fipronil sulfide

1.2.1.2 熒光衍生化反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了提高衍生效率，以衍生化反應(yīng)后HPLC-FLD檢測(cè)所得的衍生產(chǎn)物DX1的峰面積作為衡量指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對(duì)衍生化反應(yīng)主要條件進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)梯度水平設(shè)置如下：a.催化劑：選取EDC/DMAP、DCC/DMAP和PyBOP/TEA三種催化劑進(jìn)行試驗(yàn)，其他試驗(yàn)條件如下：反應(yīng)時(shí)間30 min、反應(yīng)溫度45 ℃、熒光衍生試劑與氟蟲(chóng)腈亞砜的用量比6:1、反應(yīng)溶劑為乙腈；b.反應(yīng)時(shí)間：選取15、30、45、60、75、90、105、120 min不同反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，其他試驗(yàn)條件如下：以EDC/DMAP為催化劑、反應(yīng)溫度45 ℃、熒光衍生試劑與氟蟲(chóng)腈亞砜的用量比6:1、反應(yīng)溶劑為乙腈；c.反應(yīng)溫度：選取5、15、25、35、45、55、65 ℃不同反應(yīng)溫度進(jìn)行試驗(yàn)，其他試驗(yàn)條件如下：以EDC/DMAP為催化劑、反應(yīng)時(shí)間為75 min、熒光衍生試劑與氟蟲(chóng)腈亞砜的用量比6:1、反應(yīng)溶劑為乙腈；d. n（熒光衍生試劑）/n（氟蟲(chóng)腈亞砜）：選取熒光衍生試劑與氟蟲(chóng)腈亞砜用量比為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1進(jìn)行試驗(yàn)，其他試驗(yàn)條件如下：以EDC/DMAP為催化劑、反應(yīng)時(shí)間為75 min、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)溶劑為乙腈；e.反應(yīng)溶劑：選取DCM、THF、乙腈、DMF、DMSO五種溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，其他試驗(yàn)條件如下：以EDC/DMAP為催化劑、反應(yīng)時(shí)間為75 min、反應(yīng)溫度45 ℃、熒光衍生試劑與氟蟲(chóng)腈亞砜的用量比8:1。

1.2.2 熒光衍生化反應(yīng)產(chǎn)物分離、純化及表征方法

1.2.2.1 熒光衍生化反應(yīng)產(chǎn)物的分離和純化 以EDC/DMAP為催化縮合劑、二氯甲烷為反應(yīng)溶劑，氟蟲(chóng)腈亞砜與熒光衍生試劑L2的用量比為1:8，在45 ℃水浴中反應(yīng)75 min；反應(yīng)結(jié)束后，以硅膠柱層析法對(duì)衍生產(chǎn)物N-（3-氰基-1-（2,6-二氯-4-（三氟甲基）苯基）-4-（（三氟甲基）硫代）-1H-吡唑-5-基）-4-（2-（9-乙基-9H-咔唑-3-基）-1H-菲并[9,10-d]咪唑-1-基）丁酰胺（DX1）進(jìn)行分離和純化。

1.2.2.2 熒光衍生化反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征 分離、純化后的衍生化產(chǎn)物DX1，采用1H NMR、13C NMR和HRMS等波譜檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與表征。

1.2.2.3 熒光衍生化反應(yīng)產(chǎn)物的熒光特性表征 以乙腈為溶劑，采用熒光分光光度計(jì)對(duì)DX1的熒光光譜性質(zhì)進(jìn)行掃描檢測(cè)。熒光掃描的狹縫設(shè)置為10 nm/10 nm，以最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)，通過(guò)掃描獲取發(fā)射波長(zhǎng)；同時(shí)，根據(jù)所測(cè)定的發(fā)射波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)計(jì)算Stokes位移[19?20]。

1.2.3 雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜的提取方法 根據(jù)GB 23200.115-2018 所述的方法，提取雞蛋中殘留的氟蟲(chóng)腈代謝物-氟蟲(chóng)腈亞砜和進(jìn)行測(cè)前處理[21]。將樣品雞蛋去殼，以勻漿機(jī)充分混合均勻；準(zhǔn)確稱(chēng)量5 g雞蛋勻漿液（精確至 0.01 g），置于 50 mL 離心管，加入 20 mL 色譜純乙腈溶液；手動(dòng)振蕩混合1 min，再以恒溫振蕩器振蕩 5 min；隨后向離心管中依次添加2 g 氯化鈉和 6 g 無(wú)水硫酸鈉，再手動(dòng)振蕩混合 1 min；在 4000 r/min 下離心 10 min；取上清液，4 ℃ 冰箱保存、待測(cè)。

1.2.4 氟蟲(chóng)腈亞砜柱前熒光衍生化產(chǎn)物 HPLC-FLD檢測(cè)方法 主要檢測(cè)條件如下：Symmetry C18色譜柱：4.6×250 mm, 5 μm；柱溫為 40 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為 20 μL；流動(dòng)相 A：100% 純乙腈；流動(dòng)相 B：超純水；洗脫方式：等度洗脫，A 相為80%，B 相為 20%；激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)：分別為 310和 404 nm。色譜柱在檢測(cè)前以流動(dòng)相平衡 10 min，所有檢測(cè)樣品在進(jìn)樣前均以 0.22 μm 濾膜過(guò)濾。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g新鮮雞蛋勻漿液，分別添加5、1、0.1 μg氟蟲(chóng)腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2.3中所述的方法提取雞蛋樣品中的氟蟲(chóng)腈亞砜，并以L(fǎng)2為熒光衍生試劑按1.2.1所述的方法分別進(jìn)行柱前熒光衍生化反應(yīng)，再按1.2.4中所述的HPLCFLD檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.2.5.2 檢測(cè)限和定量限計(jì)算方法 參照賈離離等[22]的方法，以3倍信噪比計(jì)算檢測(cè)限和10倍信噪比計(jì)算定量限，建立檢測(cè)回歸方程。

1.2.5.3 精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性評(píng)價(jià)方法 分別參照Madrera等[23]、Xiong等[24]、于海英等[25]的方法，進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性的評(píng)價(jià)。精密度：連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行HPLC-FLD檢測(cè)，分別記錄衍生化產(chǎn)物DX1的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。穩(wěn)定性：待測(cè)衍生化產(chǎn)物于室溫下放置，分別在第1、2、4、8、24 h進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算衍生產(chǎn)物DX1保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。重現(xiàn)性：按照1.2.2中所述的方法，重復(fù)進(jìn)行6次柱前熒光衍生化反應(yīng)試驗(yàn)，上樣檢測(cè)DX1的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行3次平行測(cè)定，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟蟲(chóng)腈亞砜柱前熒光衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 催化劑的優(yōu)選 本文所設(shè)計(jì)的氟蟲(chóng)腈亞砜柱前熒光衍生化反應(yīng)是一種脫水縮合反應(yīng)，熒光衍生試劑L2的羧基與氟蟲(chóng)腈亞砜的氨基之間進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，脫水縮合形成熒光衍生化產(chǎn)物DX1。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道[26?29]，本文選擇“DCC/DMAP”、“EDC/DMAP”和“PyBOP/TEA”三種堿性催化劑來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，以?xún)?yōu)選出高效率的催化劑。試驗(yàn)結(jié)果（如圖2a）表明，三種催化劑的效果差異非常顯著，以PyBOP/TEA為催化劑，衍生化反應(yīng)基本上不會(huì)發(fā)生；DCC/DMAP能促進(jìn)衍生化反應(yīng)，但效率顯著低于EDC/DMAP；在本文所設(shè)定的條件下，EDC/DMAP的催化效率最高。因此，EDC/DMAP為該反應(yīng)的優(yōu)選催化劑。

圖2 催化劑、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、衍生試劑與氟蟲(chóng)腈亞砜的用量比及反應(yīng)溶劑對(duì)氟蟲(chóng)腈亞砜衍生化效率的影響Fig.2 Influence of catalyzer, reaction time, reaction temperature, ratio of fipronil sulfoxide to fluorescence derivatization reagent, and reaction solvent on the derivatizing efficiency of fipronil

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 本文設(shè)置了15~105 min六個(gè)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2b所示。在15~75 min內(nèi)，衍生化產(chǎn)物的產(chǎn)量呈現(xiàn)線(xiàn)性、快速上升的趨勢(shì)；75 min時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最大；而后再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量上的小幅下降。因此，確定75 min為優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間。

2.1.3 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 如圖2c所示，在反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為75 min時(shí)，溫度對(duì)衍生化產(chǎn)物的產(chǎn)量有較大的影響。當(dāng)溫度從5 ℃上升到45 ℃時(shí)，產(chǎn)量呈上升的趨勢(shì)，特別是從35 ℃升到45 ℃時(shí)，產(chǎn)量出現(xiàn)了激增；繼續(xù)升溫，產(chǎn)量有下降的趨勢(shì)。由此可知，45 ℃為比較合適的衍生化反應(yīng)溫度。

2.1.4 衍生試劑用量的優(yōu)化 衍生試劑的用量對(duì)衍生反應(yīng)有重要影響[30]，本文選擇了11個(gè)用量進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。由圖2d可知，隨著熒光衍生試劑L2用量的增加，衍生產(chǎn)物DX1的產(chǎn)量持續(xù)增大，在n（熒光衍生試劑）/n（氟蟲(chóng)腈亞砜）為8:1時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到峰值；如果繼續(xù)增加用量，產(chǎn)量反應(yīng)會(huì)出現(xiàn)明顯的下降。上述結(jié)果表明，衍生化反應(yīng)在n（熒光衍生試劑）/n（氟蟲(chóng)腈亞砜）等于8:1時(shí)效果最佳。

2.1.5 反應(yīng)溶劑的優(yōu)選 本文選取二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃（THF）、二甲基亞砜（DMSO）以及乙腈五種常用的衍生化反應(yīng)溶劑進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以選擇出合適的反應(yīng)溶劑，結(jié)果如圖2e所示。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熒光衍生試劑L2和氟蟲(chóng)腈亞砜在DCM中反應(yīng)較為完全，目標(biāo)物產(chǎn)量顯著高于其它四種溶劑，其次是乙腈。從結(jié)果來(lái)看，THF、DMF和DMSO不適合作為衍生反應(yīng)的溶劑。在DCM中衍生化反應(yīng)效果較好，可能是因?yàn)镈CM對(duì)各反應(yīng)物都具有良好的溶解性，具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。據(jù)此，確定DCM為優(yōu)選衍生化反應(yīng)溶劑。

綜上所述，氟蟲(chóng)腈亞砜柱前衍生化反應(yīng)的優(yōu)選條件如下：EDC/DMAP為催化劑，反應(yīng)時(shí)間和衍生溫度分別為75 min、45 ℃，熒光生試劑用量為n（熒光衍衍生試劑）/n（氟蟲(chóng)腈亞砜）=8:1，二氯甲烷為反應(yīng)溶劑。

2.2 柱前熒光衍生化產(chǎn)物DX1的結(jié)構(gòu)和熒光特性表征

2.2.1 DX1結(jié)構(gòu)檢測(cè)與表征 衍生產(chǎn)物DX1：本文采用熒光衍生試劑L2對(duì)氟蟲(chóng)腈亞砜進(jìn)行柱前衍生化，所設(shè)計(jì)的目標(biāo)衍生化產(chǎn)物為N-（3-氰基-1-（2,6-二氯-4-（三氟甲基）苯基）-4-（（三氟甲基）硫代）-1H-吡唑-5-基）-4-（2-（9-乙基-9H-咔 唑-3-基）-1H-菲 并[9,10-d]咪 唑-1-基）丁 酰 胺（N-（3-cyano-1-（2,6-dichloro-4-（trifluoromethyl）phenyl）-4-（（trifluoromethyl）thio）-1H-pyrazol-5-yl）-4-（2-（9-ethyl-9Hcarbazol-3-yl）-1H-phenanthro[9,10-d]imidazol-1-yl）butanamide），命名為DX1。經(jīng)分離、純化和1H NMR、13C NMR和HRMS等檢測(cè)分析，確認(rèn)所得的衍生化產(chǎn)物是所設(shè)計(jì)的目標(biāo)物。DX1主要結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下：

DX1：白色固體，產(chǎn)率76.4%。1H NMR（400 MHz,DMSO）δ13.39（s, 1H）, 9.07（d, J=1.2 Hz, 1H）, 8.87（dd, J=13.2, 8.3 Hz, 2H）, 8.62（dd, J=22.1, 7.7 Hz,2H）, 8.45（dd, J=8.6, 1.5 Hz, 1H）, 8.29（d, J=7.7 Hz,1H）, 7.84（d, J=8.6 Hz, 1H）, 7.76（dt, J=11.0, 7.5 Hz,2H）, 7.71–7.60（m, 3H）, 7.53（t, J=7.3 Hz, 1H）, 7.31（t,J=7.4 Hz, 1H）, 5.56（d, J=7.9 Hz, 2H）, 4.54（q, J=7.1 Hz,2H）, 1.70（dd, J=16.1, 13.0 Hz, 2H）, 1.61（dd, J=9.0,3.8 Hz, 2H）, 1.24（s, 3H）.13C NMR（101 MHz, DMSO）δ156.58, 150.49, 140.07, 127.40, 127.01, 126.22,123.70, 122.47, 121.89, 120.41, 119.34, 118.27,109.49, 47.47, 37.17, 33.31, 25.29, 24.42, 13.77.Calcd for C45H29Cl2F6N7OS: 899.1436, HRMS（ESI）m/z [M+H]+: found 900.1508.

2.2.2 DX1熒光特性檢測(cè)與表征 熒光掃描檢測(cè)結(jié)果（如圖3所示）表明，衍生化產(chǎn)物DX1與熒光衍生試劑L2的熒光光譜特征基本相同，L2的最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為310和398 nm，斯托克斯位移為88 nm；DX1的最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為310和404 nm, 斯托克斯位移為94 nm，兩者的最大激發(fā)波長(zhǎng)相同，但DX1的最大發(fā)射波長(zhǎng)比L2增加6 nm，即Stokes位移增大了6 nm，較大的Stokes位移大大減少了檢測(cè)時(shí)激發(fā)光對(duì)發(fā)射光的干擾，保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。DX1的高熒光強(qiáng)度和較大的Stokes位移，為建立靈敏、準(zhǔn)確、可靠的柱前衍生化HPLC-FLD方法檢測(cè)痕量氟蟲(chóng)腈亞砜殘留提供了保證。

圖3 熒光衍生試劑L2和氟蟲(chóng)腈亞砜衍生化產(chǎn)物DX1的熒光光譜掃描圖Fig.3 Spectrograms of fluorescence scanning of fluorescent derivatization reagent L2 and its derivative DX1

2.3 氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的建立和評(píng)價(jià)

2.3.1 氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的線(xiàn)性回歸方程及檢測(cè)限和定量限 基于前述柱前衍生化反應(yīng)優(yōu)化條件和氟蟲(chóng)腈亞砜柱前衍生化產(chǎn)物DX1的HPLC-FLD檢測(cè)條件，所建立的氟蟲(chóng)腈亞砜HPLCFLD檢測(cè)方法的線(xiàn)性回歸方程為Y=194.95X?0.0609（如表1），該回歸方程的相關(guān)系數(shù)r達(dá)到了0.9999，展現(xiàn)出了良好的線(xiàn)性相關(guān)性。此外，該方法的檢測(cè)限和定量限分別達(dá)到了0.033和0.092 μg/L，具有很高的靈敏度。

表1 氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限Table 1 Linear regression equation, determination coefficient,LOD and LOQ of fipronil sulfide determination by HPLC-FLD

2.3.2 氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和精密度 氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和精密度如表2所示。從表2的數(shù)據(jù)可知，這三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的保留時(shí)間的RSD均低于0.07%，峰面積的RSD均低于2.1%。這些方法學(xué)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)表明，所建立的檢測(cè)方法穩(wěn)定、可靠，可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表2 氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性Table 2 Precision, stability and reproducibility of fipronil sulfide determination by HPLC-FLD

2.4 雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的建立和評(píng)價(jià)

2.4.1 雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率 由表3可知，本文所建立的雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈及其代謝物HPLC-FLD檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率在84.68%~94.50%范圍之內(nèi)，重復(fù)性RSD低于1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.05%~3.65%，表明該方法具有很好的回收率，提取、衍生化和檢測(cè)的結(jié)果是比較可靠的。

表3 雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜柱前衍生化HPLC-FLD檢測(cè)的加標(biāo)回收率Table 3 Recovery rate of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization

2.4.2 雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的檢測(cè)限、定量限和靈敏度 方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果表明，本文建立的雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的檢測(cè)限和定量限分別達(dá)0.052和0.132 μg/kg（如表4），具有較好的靈敏度。戴盡波等[15]建立了禽源性食品中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.1~0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。根據(jù)高霞等[17]的報(bào)道，GC-NCI/MS測(cè)定蔬菜中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜的檢出限在0.2~0.3 μg/kg之間，定量限為1.0 μg/kg。從檢測(cè)限和定量限這兩個(gè)重要的方法學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)看，本文建立的雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法已優(yōu)于HPLC-MS和GC-MS。

表4 雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的檢測(cè)限、定量限和靈敏度Table 4 LOD and LOQ of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization

2.4.3 雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性 由表5數(shù)據(jù)可知，本文建立的雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性三個(gè)指標(biāo)的保留時(shí)間RSD均低于0.04%，峰面積的RSD值均低于2.7%，表明方法穩(wěn)定、可靠。

表5 雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性Table 5 Precision, stability and reproducibility of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization

2.4.4 雞蛋中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜的檢測(cè)結(jié)果與分析采用本文所建立的HPLC-FLD檢測(cè)方法，對(duì)所采集的源自于5個(gè)省的25份雞蛋樣品中的殘留氟蟲(chóng)腈亞砜進(jìn)行了檢測(cè)與分析，結(jié)果表明（如表6和圖4），所有的25份樣品中均未檢測(cè)出氟蟲(chóng)腈亞砜，說(shuō)明本文采樣點(diǎn)產(chǎn)地的雞蛋在氟蟲(chóng)腈亞砜殘留這個(gè)指標(biāo)上是安全的。

圖4 雞蛋樣品中殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)色譜圖Fig.4 Chromatograms of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in sample eggs

表6 五省二十五份雞蛋樣品殘留氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)結(jié)果Table 6 Determination results of residual fipronil sulfide in 25 sample eggs collected from 5 provinces by HPLC-FLD

3 結(jié)論

本文建立并優(yōu)化了氟蟲(chóng)腈亞砜的柱前熒光衍生化方法，優(yōu)化后的主要反應(yīng)條件如下：催化縮合劑為EDC/DMAP；反應(yīng)溶劑為二氯甲烷；氟蟲(chóng)腈亞砜與熒光衍生試劑的用量比為1:8；45 ℃水浴中反應(yīng)75 min。衍生化所生成的目標(biāo)產(chǎn)物DX1具有很高的熒光強(qiáng)度?；跓晒庋苌磻?yīng)優(yōu)化條件和產(chǎn)物熒光特征，建立了氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法，其檢測(cè)限為0.033 μg/L，定量限為0.092 μg/L。在此基礎(chǔ)上，建立雞蛋殘留氟蟲(chóng)腈亞砜提取和檢測(cè)的HPLC-FLD方法，檢測(cè)限和定量限分別達(dá)0.052和0.132 μg/kg，精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性在保留時(shí)間和峰面積上的RSD分別小于0.04%和2.7%。上述結(jié)果表明，本文建立的氟蟲(chóng)腈亞砜HPLC-FLD檢測(cè)方法較為靈敏可靠，在雞蛋氟蟲(chóng)腈亞砜殘留檢測(cè)中具有較好的應(yīng)用前景。但氟蟲(chóng)腈在體內(nèi)的代謝比較復(fù)雜，還有氟甲腈和氟蟲(chóng)腈砜等代謝物，本文僅對(duì)氟蟲(chóng)腈亞砜建立了檢測(cè)方法，后續(xù)還需建立和完善氟蟲(chóng)腈其它代謝物的檢測(cè)方法，為氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢測(cè)與控制提供支撐。