賈全，胡利敏，任峰，張建麗，田洪年，劉樹斌

(華北制藥河北華民藥業(yè)有限責任公司，河北 石家莊052165)

頭孢他啶是由葛蘭素史克公司研制的第三代頭孢菌素類抗生素，具有廣泛的抗菌譜和良好的用藥效果[1]。國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)通常以頭孢他啶二鹽酸鹽為原料,通過等電點結晶制備頭孢他啶[2]。由于制備過程中頭孢他啶析晶不完全，導致部分產(chǎn)品仍然殘留在母液中。如果將母液直接排放至三廢，不僅影響產(chǎn)品收率，還會增加企業(yè)污水處理費用，對環(huán)境造成較大傷害，也增加了企業(yè)成本。

目前頭孢類抗生素結晶母液處理方法包括納濾膜分離法[3]、樹脂吸附法[4]、絡合法[5]、冷凍濃縮法[6-7]等。采用納濾膜分離結晶母液，設備采購及維護成本較高；使用樹脂吸附有效成分，還需要對樹脂進行再生處理，操作過程繁瑣；以苯系和萘系化合物為絡合劑進行絡合，收率較低，且使用大量易揮發(fā)性有機溶劑，極易造成大氣污染；而冷凍濃縮法作為近年來發(fā)展迅速的一種濃縮方式，其原理簡單，操作便捷，已被廣泛應用于食品加工、釀酒業(yè)、中藥等領域[8-11]。

冷凍濃縮法根據(jù)結晶方式的不同，又分為懸浮結晶冷凍濃縮法和漸進冷凍濃縮法。懸浮結晶冷凍濃縮法是一種不斷排除在母液中懸浮的自由小冰晶，使母液濃度增加而實現(xiàn)濃縮的方法。漸進冷凍濃縮是一種隨著冰層在冷卻面的生成和成長，固液界面附近的溶質(zhì)被排除到液相側(cè)，導致液相中溶質(zhì)質(zhì)量濃度逐漸升高的濃縮方法。文獻[7]以頭孢他啶結晶母液為原料，使用漸進冷凍濃縮法進行回收處理，考察了冷凍溫度、冷凍時間對頭孢他啶回收效果的影響，但此方法冰晶夾帶率高，易損失物料，且單因素試驗得到的結果精度不夠，無法取得最佳參數(shù)點。

本研究先將結晶母液進行除鹽處理，再采用懸浮結晶冷凍濃縮方法對頭孢他啶母液進行研究，此方法較漸進冷凍濃縮方式具有能耗低、效率高、提取充分等特點。在單因素試驗基礎上，利用響應面設計優(yōu)化頭孢他啶母液冷凍濃縮工藝，優(yōu)化后的工藝可有效提高產(chǎn)品總收率，具有效率高、提取充分等特點，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

頭孢他啶二鹽酸鹽(河北金旭藥業(yè))；頭孢他啶母液(華北制藥河北華民藥業(yè)有限責任公司)；實驗室用冷凍濃縮罐(石家莊眾泰不銹鋼設備制造廠)；1260高效液相色譜儀(美國Agilent)；V20卡爾費休水分儀(美國Mettler Toledo)。

1.2 試驗方法

頭孢他啶結晶母液制備工藝[12]：將60 g頭孢他啶二鹽酸鹽原料加入90 mL純化水中，攪拌控溫10 ℃，向其中加入4 mol/L氫氧化鈉，將pH調(diào)至5.60，再用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.5，加入0.06 g頭孢他啶，繼續(xù)用磷酸調(diào)pH至3.75，過濾分離頭孢他啶晶體后，得到頭孢他啶結晶母液，濃度15～20 mg/mL。

除鹽母液制備工藝：取頭孢他啶母液降溫至-5 ℃，用固體氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.5，將固液混合物過濾，得到除鹽母液。

懸浮結晶冷凍濃縮工藝：將500 mL濃度為15 mg/mL頭孢他啶除鹽母液泵入到帶有夾套的實驗室用冷凍濃縮罐，控制冷媒溫度，待貼近罐壁的液體開始冷凍后，緩慢轉(zhuǎn)動框式攪拌槳將凍冰層刮下形成細小的冰晶，懸浮的冰晶逐漸長大，冷凍一段時間后，經(jīng)離心分離出冰相即得到濃縮母液。

漸進冷凍濃縮工藝：在冷凍濃縮反應罐中加入頭孢他啶結晶母液，關閉進料閥，開啟冷媒進出口閥門，向內(nèi)盤管通入冷媒，調(diào)節(jié)反應罐內(nèi)溫度至-5 ℃以下，控制冷凍時間3 h，打開氮氣閥門加壓，將未凍液體經(jīng)過濾布層接出即得到頭孢他啶冷凍濃縮母液。

濃縮母液套用工藝：使用懸浮結晶冷凍濃縮工藝制備出的濃縮母液替代溶解用的純化水，其余操作與頭孢他啶結晶母液制備工藝過程一致。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Process flowchart

1.3 頭孢他啶回收率的測定方法

頭孢他啶回收率的計算如下式所示：

(1)

式中，i為頭孢他啶回收率;v為除鹽母液體積,mL；m為冰晶質(zhì)量，g;w1為除鹽母液含量，mg/mL；w2為冰晶含量，mg/mL。

冰晶質(zhì)量的測定：將冰晶與濃縮母液離心分離，升溫至冰晶完全解凍，稱量解凍液的質(zhì)量；

除鹽母液含量的測定：取解凍液，按照《中國藥典》二部2015版[13]中頭孢他啶含量測定項下色譜條件進樣測定，計算樣品中所含頭孢他啶的濃度；

冰晶含量的測定：取解凍液，方法同除鹽母液含量測定。

1.4 試驗設計

根據(jù)1.2節(jié)懸浮結晶冷凍濃縮工藝進行單因素試驗，分別確定冷凍溫度、冷凍時間、攪拌速率等條件對冰晶質(zhì)量、冰晶含量的影響。

根據(jù)單因素試驗結果，采用Design-Expert軟件進行響應面設計，以冷凍溫度(A)、冷凍時間(B)、攪拌速率(C)為自變量，頭孢他啶回收率(Y)為響應值設計試驗，各因素及水平見表1。

表1 響應面設計因素及水平Table 1 Factors and levels of the response surface method

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 冷凍溫度的影響

根據(jù)1.2節(jié)懸浮結晶冷凍濃縮工藝進行試驗，在冷凍時間2 h，攪拌速率10 r/min條件下，分別設定冷凍溫度為-1、-3、-5、-7、-9、-11、-13 ℃，在出現(xiàn)冰晶后開始計時，60 min后冷凍離心，并測定冰相中頭孢他啶的含量和冰晶質(zhì)量。如圖2所示，冷凍溫度直到降至-5 ℃以下，冰晶質(zhì)量才明顯增多，-5～-13 ℃時增量變緩，且冰晶形成過程夾帶部分頭孢他啶一同析出，冰晶含量開始升高。因此，選擇冷凍溫度-5～-7 ℃。

圖2 冷凍溫度對冰晶含量和冰晶質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of freezing temperature on ice crystal content and quality

2.1.2 冷凍時間的影響

根據(jù)1.2節(jié)懸浮結晶冷凍濃縮工藝進行試驗，在攪拌速率10 r/min、冷凍溫度-5 ℃的條件下，分別冷凍30、60、120、180、240 min之后冷凍離心，并測定冰相中頭孢他啶的含量和冰晶質(zhì)量。如圖3所示，冰晶質(zhì)量隨冷凍時間延長，逐漸增多，冷凍時間達到180 min后，冰晶形成速度放緩，且冰晶含量明顯升高。因此，選擇冷凍時間180 min。

圖3 冷凍時間對冰晶含量和冰晶質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of freezing time on ice crystal content and quality

2.1.3 攪拌速率的影響

根據(jù)1.2節(jié)懸浮結晶冷凍濃縮工藝進行試驗，在冷凍時間3 h、冷凍溫度-5 ℃的條件下，分別設定攪拌速率10、20、30、40 r/min之后冷凍3 h，并測定冰相中頭孢他啶的含量和冰晶質(zhì)量。如圖4所示，框式攪拌速率在40 r/min增速的過程中，由于結冰過快導致產(chǎn)品直接包裹在冰塊中，速率越快，在攪拌作用下，冰晶顆粒越細小，表面積越大，增加了冰晶與產(chǎn)品分離的難度；另一方面轉(zhuǎn)速過快，消耗功率增加。因此，選擇攪拌速率20 r/min。

圖4 攪拌速率對對冰晶含量和冰晶質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of stirring rate on ice crystal content and quality

2.2 響應面設計結果及分析

2.2.1 設計方案及結果

根據(jù)因素水平設計得出本試驗方案及結果(表2)，對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，可以得到頭孢他啶回收率與各因素變量的回歸方程模型：

表2 Box-Behnken響應面設計方案及結果Table 2 Scheme and results of the Box-Behnken response surface design

Y=93.11-0.37A+3.19B+0.19C+0.12AB+0.12AC-1.00BC-4.43A2-8.30B2-5.55C2。

2.2.2 響應面方差分析

表3 方差分析Table 3 Results of variance analysis

續(xù)表3

2.2.3 響應面的交互分析

利用Design-Expert軟件可以得到等高線圖和3D響應面圖，等高線的形狀可以反映兩者交互作用的強弱，圓形代表交互作用弱，橢圓形代表交互作用強。

觀察圖5發(fā)現(xiàn)，當攪拌速率不變時，隨著冷凍溫度降低，回收率先逐漸增大再逐漸減小，當冷凍溫度為-7 ℃時，回收率達到峰值；當冷凍溫度不變時，隨著攪拌速率的增加，回收率先逐漸增大再逐漸減小，當攪拌速率為20 r/min時，回收率達到峰值。根據(jù)等高線的形狀可知攪拌速率和冷凍時間交互作用最弱。

圖5 攪拌速率和冷凍溫度對頭孢他啶回收率影響的響應面圖譜Fig.5 Response surface graphs of the effects of stirring rate and freezing temperature on the recovery of ceftazidime

觀察圖6發(fā)現(xiàn)，當冷凍時間不變時，隨著冷凍溫度降低，回收率先逐漸增大再逐漸減小。當冷凍溫度為-7 ℃時，回收率達到峰值；當冷凍溫度不變時，隨著冷凍時間的增加，回收率先逐漸增大再逐漸減小，冷凍時間2～3 h時，回收率明顯增加，冷凍時間在3～4 h時，回收率變化減緩，當冷凍時間為3 h時，回收率達到峰值。根據(jù)等高線的形狀可知攪拌速率和冷凍時間交互作用較強。

圖6 冷凍時間和冷凍溫度對頭孢他啶回收率影響的響應面圖譜Fig.6 Response surface graphs of the effects of freezing time and temperature on the recovery of ceftazidime

觀察圖7發(fā)現(xiàn)，當攪拌速率不變時，隨著冷凍時間增加，回收率先逐漸增大再逐漸減小，冷凍時間2～3 h時，回收率明顯增加，冷凍時間在3～4 h時，回收率變化減緩，當冷凍時間為3 h時，回收率達到峰值；當冷凍時間不變時，隨著攪拌速率的增加，回收率先逐漸增大再逐漸減小，當攪拌速率為20 r/min時，回收率達到峰值。根據(jù)等高線的形狀可知攪拌速率和冷凍時間交互作用最強。

圖7 攪拌速率和冷凍時間對頭孢他啶回收率影響的響應面圖譜Fig.7 Response surface graphs of the effects of stirring rate and freezing time on the recovery of ceftazidime

2.3 響應面最優(yōu)條件的確定及驗證

通過Design-Expert軟件對試驗參數(shù)進行擬合預測，得到最佳回收條件：冷凍溫度-7.08 ℃、冷凍時間3.19 h、攪拌速率19.99 r/min，預測頭孢他啶回收率將達到93.42%。

進一步驗證模型方程的適用性與可靠性，結合生產(chǎn)實際可操作性，采用冷凍溫度-7 ℃、冷凍時間3 h、攪拌速率20 r/min，進行母液中頭孢他啶的回收試驗，平行試驗3次，結果頭孢他啶的平均回收率達到93.15%，與理論值誤差為-0.27%，表明擬合模型適用于優(yōu)化頭孢他啶母液回收處理的工藝參數(shù)，詳見表4。

表4 驗證試驗結果Table 4 Verification test results

2.4 濃縮母液套用試驗

按照1.2節(jié)濃縮母液套用工藝進行試驗，與現(xiàn)有技術方法套用試驗結果做對比。試驗1分別是為應用懸浮結晶冷凍濃縮方法未套用和套用制備的樣品，試驗2分別為應用漸進冷凍濃縮方法未套用和套用制備的樣品，試驗3分別為應用初始母液進行未套用和套用制備的樣品。由表5中試驗數(shù)據(jù)可以看出，應用懸浮結晶冷凍濃縮方法套用制備頭孢他啶的整體收率提升明顯，由表6中檢測結果可以看出，制備的樣品質(zhì)量指標與現(xiàn)有技術基本一致。

表5 對比實驗Table 5 Comparative experiment

表6 頭孢他啶主要質(zhì)量指標情況Table 6 Main quality indexes of ceftazidime

3 討論

本研究采用懸浮結晶冷凍濃縮方法處理頭孢他啶母液，在單因素試驗基礎上通過響應面設計優(yōu)化冷凍濃縮工藝參數(shù),得出最佳工藝條件為：冷凍溫度-7 ℃，冷凍時間3 h，攪拌速率20 r/min。經(jīng)過驗證，優(yōu)化后工藝參數(shù)穩(wěn)定，頭孢他啶回收率達到93.15%，套用質(zhì)量收率達到92.6%，比未套用母液的質(zhì)量收率提升約8.3%，比應用漸進冷凍濃縮方法的質(zhì)量收率提升約0.9%。該工藝操作簡單、重復性好，具有實用價值，可為頭孢他啶的后續(xù)研究提供參考。