常 麗，卞勇華，邱 靜，黃思怡，史衛(wèi)紅

食管癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居世界癌癥死因第6位, 中國(guó)癌癥死因第4位，且總體5年生存率僅為20%～30%，中晚期患者失去手術(shù)機(jī)會(huì)，常規(guī)放化療的5年生存率不到10%，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1-2]。目前手術(shù)治療是主要治療方案，但術(shù)后易侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，數(shù)據(jù)顯示術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)22.5%[3]，因此需探尋食管癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的相關(guān)細(xì)胞因子具有重要臨床價(jià)值。白介素-18（IL-18）在調(diào)控腫瘤微環(huán)境的免疫功能以及抗血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如可調(diào)節(jié)Th1 /Th2細(xì)胞的分化，活化CD4+和CD8+T細(xì)胞，以及促進(jìn)Fas-FasL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。白介素-18結(jié)合蛋白( interleukin-18 binding protein, IL-18BP)是IL-18內(nèi)源性抑制物，可拮抗IL-18功能，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及遷移等生物學(xué)行為，其中IL-18BPc是其的一種具有生物學(xué)活性的亞型[5]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)屬于細(xì)胞黏附性分子，其的下調(diào)、缺失或者功能障礙均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，增加了術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[6]。IL-18、E-cadherin和IL-18BPc均參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但與食管癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及生存期的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本次研究結(jié)合臨床病理資料分析檢測(cè)IL-18、E-cadherin、IL-18BP的表達(dá)與食管癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為尋找預(yù)后判斷及治療相關(guān)的分子靶標(biāo)開(kāi)辟新途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取食管癌的64例患者，獲取食管癌組織標(biāo)本（研究組）以及正常癌旁組織標(biāo)本（對(duì)照組）。入組患者男、女分別為48例、16例，年齡40～72歲。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟于2009年修訂食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]，Ⅰ期8例、Ⅱ期28例、Ⅲ期24例，IV期4例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。本研究已通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）對(duì)照組患者經(jīng)病理組織活檢確診為食管鱗狀細(xì)胞癌；2）尚未開(kāi)始放化療的食管鱗患者，均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）已接收放化療治療；2）病例資料不完整者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化法檢測(cè)IL-18、E-cadherin和IL-18BPc表達(dá)水平 應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)患者標(biāo)本中IL-18、E-cadherin和IL-18BPc表達(dá)水平。術(shù)中切除食管癌組織以及正常癌旁組織，采用甲醛溶液（40 g/L）固定，并進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度4 μm），采用免疫組織化學(xué)染色以及蘇木精-伊紅染色。脫水脫蠟處理后抗原修復(fù)液（0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液）修復(fù)15 min，隨后磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）沖洗切片，加入非免疫血清孵育約10 min。切片滴加一抗鼠抗人IL-18、E-cadherin或IL-18BPc單克隆抗體并4℃過(guò)夜，PBS緩沖液沖洗3～4次，加入新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺溶液，之后蒸餾水漂洗、蘇木精復(fù)染，脫水、封片后于顯微鏡下觀察IL-18、E-cadherin、IL-18BPc表達(dá)情況。

胞質(zhì)中呈棕黃色或棕褐色顆粒表明IL-18BPc或IL-18呈陽(yáng)性，細(xì)胞膜呈棕黃褐色表明 E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性。顯微鏡下半定量積分法判斷陽(yáng)性結(jié)果，于200倍視野下隨機(jī)選取3個(gè)視野，對(duì)每張切片的染色強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞占比計(jì)分，染色強(qiáng)度分為0分（無(wú)色）、1分（淺黃色）、2分（棕黃色）以及3分（黃褐色），陽(yáng)性細(xì)胞占比分為0分（≤5%）、1分（6% ～25%）、2分（26% ～50%）以及3分（>50%）四個(gè)分值[8]。上述染色強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞占比得分相乘，所得結(jié)果為 0、1～3、4～6、7～9分，分別代表陰性（-）、弱陽(yáng)性（+）、中等陽(yáng)性（++）、強(qiáng)陽(yáng)性（+++），得分<1分，則表明為陰性，否則為陽(yáng)性。由兩位病理醫(yī)師單獨(dú)完成染色評(píng)估，取其共同結(jié)論為最終結(jié)果，若結(jié)果存在爭(zhēng)議，以二者討論后確定的結(jié)論為準(zhǔn)。

1.2.2 收集臨床資料 臨床資料主要包括包括性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期以及5年生存情況。比較不同臨床資料患者的IL-18、E-cadherin和IL-18BPc表達(dá)水平有無(wú)差異，并進(jìn)行Spearman相關(guān)分析以及影響因素分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用例數(shù)(%)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，采用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，用Kaplan-Meier法描述腫瘤組織中不同IL-18、E-cadherin和IL-18BPc水平的生存率，影響因素分析采用Logistic回歸分析，生存率之間的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 IL-18、E-cadherin和IL-18BPc的 表 達(dá) 情況 研究組IL-18、E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性率低于對(duì)照組，IL-18BPc表達(dá)陽(yáng)性率高于對(duì)照組，研究組的E-cadherin強(qiáng)陽(yáng)性（+++）率低于對(duì)照組，IL-18BPc強(qiáng)陽(yáng)性（+++）率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1～表3。

表1 IL-18在兩組中的表達(dá)

表2 E-cadherin在兩組中的表達(dá)

表3 IL-18BPc在兩組中的表達(dá)

2.2 不同臨床資料患者中IL-18、E-cadherin和IL-18BPc的表達(dá) IL-18、E-cadherin和IL-18BPc陽(yáng)性率在不同年齡、性別患者中的表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、不同生存時(shí)間患者中的陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見(jiàn)表4。

表4 不同臨床資料患者中，IL-18、E-cadherin和IL-18BPc的表達(dá)

2.3 相關(guān)性分析 64例患者隨訪5年，死亡49例，中位生存時(shí)間33個(gè)月，采用Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，IL-18、E-cadherin和IL-18BPc分別與生存時(shí)間均具有相關(guān)性，r分別為0.638、0.578、-0.529，P值均低于0.05。

2.4 食管癌組織IL-18、E-cadherin和IL-18BPc水平與影響生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素分析 以患者是否死亡為因變量（是=1，否=0），以IL-18、E-cadherin和IL-18BPc表達(dá)水平（陽(yáng)性=1，陰性=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是=1，否=0）、TNM分期（Ⅰ、Ⅱ期=1，Ⅲ、Ⅳ期=0）為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，研究顯示IL-18、E-cadherin和IL-18BPc、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期均是影響患者生存情況的危險(xiǎn)因素（P<0.05），見(jiàn)表5。IL-18、E-cadherin 高表達(dá)者的5 年生存率（36.67%、35.29%）高于低表達(dá)者（11.76%、10.00%），而IL-18BPc高表達(dá)者的5 年生存率（16.67%）低于低表達(dá)者（43.75%），見(jiàn)圖1～圖3。

表5 患者生存情況影響因素Logistic回歸分析

圖1 IL18表達(dá)與食管癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

圖2 E-cadherin表達(dá)與食管癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

圖3 IL-18BPc表達(dá)與食管癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

3 討論

食管癌包括食管鱗狀細(xì)胞癌、食管腺癌兩種病理類(lèi)型，其中我國(guó)以鱗癌為主（占90%以上），晚期食管癌治療仍是世界性的難題[9]，尋找食管癌診斷的分子標(biāo)志和治療靶點(diǎn)對(duì)于食管癌的治療具有指導(dǎo)意義。IL-18主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)Fas介導(dǎo)的NK細(xì)胞的T細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞釋放大量的IFN-γ、GM-CSF，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)，如黑色素瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞等[10-11]。IL-18BP是IL-18天然的拮抗物，一方面通過(guò)抑制IL-18相關(guān)的生物學(xué)活性而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還可通過(guò)促進(jìn)骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員和分化以及活化VEGF/Akt信號(hào)途徑而刺激新生血管生成，其中IL-18BPc是有生物學(xué)活性的IL-18BP的一種亞型，可通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管形成，誘導(dǎo)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[12]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)研究組IL-18、E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性率低于對(duì)照組，IL-18BPc表達(dá)陽(yáng)性率高于對(duì)照組（P<0.05），與劉檢等報(bào)道一致[13-14]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)IL-18、E-cadherin、IL-18BPc在食管癌組織中的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、生存時(shí)間密切關(guān)聯(lián)(P<0.05)，提示IL-18、IL-18BPc對(duì)于評(píng)估食管癌的進(jìn)展及預(yù)后均具有重要意義。IL-18在機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，同時(shí)還能參與腫瘤細(xì)胞逃避免疫識(shí)別機(jī)制，以及增加sICAM-1、E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)血管壁的粘附和抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。IL-18、IL-18BPc形成一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，調(diào)節(jié)Th1反應(yīng)，共同調(diào)控免疫功能，兩者表達(dá)水平的失衡導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)功能減弱，導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散至相鄰組織、區(qū)域淋巴結(jié)受累等，最終增加治療難度，故而Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示IL-18、IL-18BPc分別與生存時(shí)間均具有相關(guān)性。

E-cadherin是介導(dǎo)細(xì)胞間連接的一種關(guān)鍵糖蛋白，作為胃癌、乳腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤的預(yù)測(cè)標(biāo)志物之一，其表達(dá)水平也會(huì)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后[16]。E-cadherin是重要的下調(diào)上皮標(biāo)志物，通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞間的連接而抑制侵襲和轉(zhuǎn)移[17]，本次研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中E-cadherin低水平表達(dá)，表明轉(zhuǎn)移能力增加，故而E-cadherin陽(yáng)性患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于E-cadherin陰性患者。郝雁冰等[18]研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤肌層浸潤(rùn)深度呈一定程度的負(fù)相關(guān)性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)程度越深的患者食管癌組織中E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)，與本次研究結(jié)果一致，即E-cadherin表達(dá)降低或者功能缺失，腫瘤細(xì)胞的活動(dòng)能力范圍增加，脫離原發(fā)灶，故而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)能力增加。同時(shí)，Rao等發(fā)現(xiàn)E-cadherin減少還可導(dǎo)致E-cadherin復(fù)合物的降解，誘導(dǎo)β-鏈蛋白入細(xì)胞核并在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集，進(jìn)而激活WNT信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19-20]。腫瘤組織中E-cadherin、IL-18低表達(dá)，而IL-18BPc高表達(dá)，腫瘤處于高分期狀態(tài)，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)三者表達(dá)水平與管癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切關(guān)聯(lián)，故而此次研究發(fā)現(xiàn)IL-18、E-cadherin高表達(dá)者的5年生存率（36.67%、35.29%）高于低表達(dá)者（11.76%、10.00%），而IL-18BPc高表達(dá)者的5年生存率（16.67%）低于低表達(dá)者（43.75%）。因此，可通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織中IL-18、IL-18BPc、E-cadherin表達(dá)水平評(píng)估預(yù)后情況，并針對(duì)性開(kāi)展采取治療措施，降低死亡率。

綜上所述，IL-18、E-cadherin和IL-18BPc均在食管癌組織中異常表達(dá)，表達(dá)水平與患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后情況具有相關(guān)性，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。