王 紅，曲鵬飛，鄧為民，韓俊泉，楊景明，張雨田，楊朝帥，王悅豪，馮彬彬，李慧臻

膽固醇結石病是臨床常見的疾病之一，我國普通人群膽石病的患病率為l0%左右，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。目前超過80%的膽石癥患者為膽囊膽固醇結石[2]。膽固醇結石屬于常見病，但其在治療方面仍存在很多問題，如藥物溶石、體外超聲波碎石不徹底；保膽取石術容易復發(fā)[3]。因此預防膽固醇結石的產生，具有很強的實際需要及社會經濟價值。

膽固醇結石發(fā)生與膽汁膽固醇水平有密切關系[4-5]。近些年發(fā)現(xiàn)，小腸（腸-肝軸）對膽汁中膽固醇有重要影響。小腸吸收的膽固醇大量轉運至肝，繼而轉運至膽汁，膽汁中膽固醇過飽和并破壞“三角關系”[6]，導致膽固醇結石形成。

中醫(yī)藥在治療膽結石尤其是膽囊膽固醇結石方面顯示出了很好的臨床療效[7-9]，并圍繞“膽病從肝論治”，從“土壅木郁”理論入手探討膽固醇結石防治的新策略。現(xiàn)代醫(yī)學證實小腸的消化吸收等大部分功能屬中醫(yī)“脾主運化“范疇，脾五行屬土，肝主疏泄歸于木，二者遵循五行克復乘侮規(guī)律，腸-肝（膽）途徑的膽石發(fā)病符合的“脾虛濕勝、土壅木郁反克肝木”的病機演變模式。因此，探討中藥如何調控腸-肝軸膽固醇代謝、調控膽道運動的效應及機制，將是預防膽石病發(fā)生的新方法。本研究通過觀察其對小腸組織Niemann-Pick C1樣蛋白1（NPC1L1）、肝組織中B1型清道夫受體(SRB1)、膽囊收縮素(CCK)信號通路的影響，為“土壅木郁”理論從“腸-肝”軸治療、預防膽固醇結石提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性普通級Hartley豚鼠，12周齡，體質量250～300 g，由北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心提供，合格證號：SCXK(京)2014-0003。動物飼養(yǎng)于天津市醫(yī)藥科學研究所。高脂飼料（10%豬油、0.5%膽固醇、89.5%基礎飼料）及普通飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 藥物 參苓白術散（批號：20160401，規(guī)格：6 g/100粒，山東方健制藥有限公司）；依折麥布片（批號：ZEZPA16001，規(guī)格：10 mg/片，MSD Pharma (Singapore) Pte. Ltd.）。

1.3 試劑與儀器 血清總膽固醇（TC，批號：822RBO）；三酰甘油（TG，批號：826RCO）；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C，批號：824RLN）；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C，批號：823RAO）生化檢測試劑盒購自中國積水醫(yī)療科技有限公司。總膽汁酸測定試劑盒及蛋白定量測試盒購自南京建成生物工程研究所。NPC1L1購自生工生物工程(上海)股份有限公司。SRB1、CCK試劑盒均購自上海藍基生物科技有限公司。KHB ST-360型酶標儀（上?？迫A生物工程股份有限公司）；BX53型偏光顯微鏡、DP73型顯微鏡攝像頭、SZ2-STS型體視顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.4 分組、造模及給藥 雄性普通級Hartley豚鼠60只，適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為對照組、模型組、依折麥布組、參苓白術散高、中、低劑量組，每組10只。對照組予普通飼料，其余組均予高脂飼料，在室內溫度20～25℃，相對濕度40%～70%，明暗周期12 h/12 h條件下喂養(yǎng)8周，建立膽固醇結石模型。造模4周后，開始藥物灌胃干預，給藥劑量10mL/kg。依折麥布組予依折麥布混懸液1 mL/kg，參苓白術散高、中、低劑量組分別予參苓白術散0.85、8.5、17 g/kg，模型組和對照組予等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)4周。期間各組動物自由飲水攝食。

1.4 取材 末次給藥后，各組禁食不禁水12 h，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，靜置30 min 后，3 000r/min離心10 min，-80 ℃凍存?zhèn)溆?；取肝組織、末端回腸、遠端空腸，-80℃保存，另取肝組織用10%中性福爾馬林固定，行組織病理學HE染色觀察；結扎膽囊管并完整取下膽囊，收集膽囊膽汁并觀察成石情況，并測定膽囊膽汁。

1.5 指標檢測及方法

1.5.1 血生化檢測血清TC、TG 使用全自動生化分析儀檢測各組豚鼠血清中TC、TG的含量。

1.5.2 膽囊膽汁膽固醇、總膽汁酸測定 膽汁保存于-20 ℃。采用酶比色法，磷脂測定采用酶顯色法，按試劑盒說明進行測定。

1.5.3 HE染色觀察肝臟組織形態(tài)學變化 將肝臟組織置于10%中性甲醛溶液固定24 h，逐級乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，采用HE染色法，光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)學變化。

1.5.4 膽囊膽固醇結晶及結石鑒定結石判斷標準 肉眼觀察膽汁內有成形粗大顆粒；細針穿刺膽囊吸取膽汁，滴少量于載玻片上制成膽汁涂片，在OLYMPUS BX53型偏光顯微鏡，配OLYMPUSDP73型顯微鏡攝像頭觀察。膽固醇結晶定量標準：取部分新鮮膽囊膽汁離心，沉淀物涂片，光鏡下觀察有無膽固醇結晶。

1.5.5 酶聯(lián)免疫吸附法測定小腸組織NPC1L1、肝組織中SRB1和CCK的表達 取各組動物小腸及肝組織，提取組織裂解液，嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析；多個樣本率比較采用χ2檢驗；相關分析采用Pearson相關；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝臟及膽囊肉眼外觀及顯微鏡下外觀 正常組豚鼠肝臟外觀呈暗紅色，質地柔軟，膽囊內膽汁透明清亮，無顆粒狀物質存在。而模型組豚鼠肝臟可見點狀脂肪沉積，膽囊內膽汁渾濁，可見多個黑色顆粒沉積。依折麥布組膽囊內膽汁較澄明，無沉積物；參苓白術散中、高劑量組肝臟無明顯點狀脂肪堆積，膽囊內膽汁澄明，無沉積物；參苓白術散低劑量組肝臟體積、外觀、質地較模型組略有好轉，但膽囊內膽汁較渾濁。見圖1。

圖1 各組豚鼠的肝臟及膽囊外觀

2.2 體視顯微鏡下膽囊中結石情況 參苓白術散各組和依折麥布組的結石發(fā)生情況明顯少于模型組，依折麥布組和參苓白術散高劑量組效果最好，成石最少，見圖2。

圖2 顯微鏡下各組豚鼠膽囊中膽汁成石情況

2.3 膽汁膽固醇結晶 對照組豚鼠膽囊膽汁內未見膽固醇結晶，模型組膽汁內可見典型的膽固醇針狀結晶；依折麥布組膽汁內膽固醇結晶稀少；參苓白術散中、高劑量組膽汁內膽固醇結晶較模型組明顯減少，參苓白術散低劑量組膽汁內膽固醇結晶有減少趨勢。見圖3。

圖3 偏振光顯微鏡下各組豚鼠膽汁膽固醇結晶情況

2.4 肝臟病理組織學觀察 對照組肝臟組織基本正常；模型組可見彌漫性大泡性脂肪變，肝組織內廣泛的肝細胞氣球樣變、少量炎細胞浸潤和點狀細胞壞死；依折麥布組脂肪變性顯著減輕；參苓白術散中、高劑量組脂肪變性及肝細胞氣球樣變顯著減輕；參苓白術散低劑量組肝細胞脂肪樣變性改善較模型組不明顯。見圖4。

圖4 各組豚鼠肝組織HE染色（×200）

2.5 各組豚鼠血清中TG、TC及膽汁總膽固醇、總膽汁酸水平比較 與對照組相比，模型組豚鼠TC、TG含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，參苓白術散高、中劑量組及依折麥布組TC、TG含量均下降（P＜0.01）。與對照組相比，模型組的總膽汁酸、總膽固醇含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，參苓白術散低劑量組總膽汁酸、總膽固醇未見明顯下降，而參苓白術散中、高劑量組與依折麥布組的總膽汁酸、總膽固醇明顯下降（P＜0.01），見表1。

表1 各組豚鼠血清TG、TC及膽汁總膽固醇、總膽汁酸水平比較

2.6 各組豚鼠空腸組織NPC1L1、肝組織SRB1、CCK受體表達水平比較 與對照組比較，模型組NPC1L1、SRB1表達明顯升高，CCK明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，參苓白術散高、中劑量組NPC1L1、SRB1表達顯著降低（P＜0.01）；參苓白術散高劑量組和依折麥布組的CCK均較模型組升高（P＜0.01），見表2。

表2 各組豚鼠小腸組織中NPC1L1、肝組織中SRB1、CCK受體表達水平比較

3 討論

歷代中醫(yī)學文獻中并無“膽囊膽固醇結石”病名，膽囊膽固醇結石是現(xiàn)代醫(yī)學病名。普遍認為膽石癥病機基于“膽病從肝論治”的疏肝理氣、疏肝化瘀、疏肝利膽、清熱利膽”等方法的研究取得了許多成果[10-11]。而膽汁中膽固醇過飽和造成膽囊結石的中醫(yī)病機過程是一個“肝郁脾虛、土壅木郁”互為因果（腸-肝互動）的動態(tài)過程。五臟分屬五行，其中脾主運化而歸屬于土，肝主疏泄而歸于木?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗分杏涊d“濕淫所勝”的脾虛生濕，濕邪壅塞之脾土太過，反侮肝木之證。基于脾虛濕郁、土壅木郁在一定階段起著重要的作用，所以此機制也不容忽視[12]。

而現(xiàn)代醫(yī)學中小腸的消化吸收等大部分功能屬中醫(yī)“脾臟主運化”（一為運化精微，一為運化水液）功能范疇，另外現(xiàn)代醫(yī)學中肝分泌、影響膽汁的排泄也在中醫(yī)“肝主疏泄”范圍內[13]，所以腸-肝軸途徑的膽石發(fā)病機制比較符合中醫(yī)的“肝郁脾虛木勝克土、土壅木郁反克肝木”互為因果的病機演變模式，這是客觀存在的[14]。而對于治療“濕淫所勝”導致的濕邪壅塞之脾土太過反侮肝木之證，治法宜健脾滲濕，而參苓白術散作為健脾滲濕的經典方劑，用來治療“土壅木郁”引發(fā)的疾病比較恰當。

膽固醇結石的發(fā)生與膽固醇代謝異常關系密切，其中主要涉及到肝臟、膽囊、腸道。人體膽固醇來源主要為腸道吸收和肝臟合成。小腸道吸收腸腔中食物及膽汁中的膽固醇進入人體，此過程需要小腸上皮細胞刷狀緣上的NPC1L1參與，當NPC1L1介導的膽固醇進入人體后通過血液循環(huán)到達肝臟，在肝細胞基底膜的表達的SRB1攝取血漿中的膽固醇進行肝臟的膽固醇代謝，然后肝臟再通過膽汁將膽固醇排入小腸。而部分肝臟分泌的膽汁進入膽囊，通過膽囊收縮排入小腸。

NPC1L1在小腸吸收膽固醇過程中非常重要，小腸中的膽固醇酯水解為游離膽固醇后，需要通過NPC1L1才能進入吸收細胞，最后進入淋巴循環(huán)。Altmann等[15]發(fā)現(xiàn)NPC1L1基因敲除小鼠與正常小鼠對比，NPC1L1缺陷小鼠的小腸血漿中及膽囊中膽固醇水平下降，小鼠膽囊成石率降低。

HDL-C是人體膽汁中膽固醇的主要來源[16]，當SRB1在肝細胞中表達水平升高會造成膽汁中的膽固醇過飽，引起膽結石形成[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，相比于對照組患者，膽石癥組患者的SRB1表達明顯上升。而SRB1表達缺陷的小鼠其血漿膽固醇水平增加，膽汁膽固醇水平降低[18-19]。

膽囊運動遲滯的初期導致膽汁淤積，而在后期會使膽固醇結晶排出障礙，膽固醇結晶逐漸堆積形成結石[20]。而膽囊的運動主要依靠腸道黏膜分泌CCK、胃動素與膽囊相關受體結合[21-22]。當十二指腸和空腸黏膜釋放CCK的量減少，會引起膽囊運動減弱。而膽囊運動遲滯導致膽囊易析出膽固醇結晶、膽囊排出膽固醇結晶障礙，使得膽石癥發(fā)生概率變大[23]。

與模型組相比，參苓白術散低、中、高劑量組豚鼠NCP1L1水平上升，CCK、SRB1表達均下降，其中中、高劑量組變化顯著（P＜0.01）。同時中、高劑量參苓白術散組血漿TC、TG、LDL-C均下降，HDL-C升高，膽汁總膽固醇明顯下降（P＜0.01）。模型組可見明顯膽汁膽固醇結晶，而依折麥布和參苓白術散低、中、高劑量組結晶稀少，其中，參苓白術散中、高劑量組的結晶明顯減少。模型組的肝臟病理出現(xiàn)明顯脂肪變性，膽囊內膽汁更加黏稠，而參苓白術散組的肝臟病理脂肪變性不明顯，膽囊內膽汁更加澄明，無沉積物。表明參苓白術散可能通過抑制豚鼠小腸上NCP1L1表達來降低小腸對膽固醇的吸收，使得進入肝臟脂代謝的膽固醇減少；降低肝臟中SRB1的表達水平，使得肝細胞減少從血漿中攝取膽固醇，降低肝臟的脂肪變，肝臟進而減少通過膽汁向小腸排泄膽固醇；促進小腸分泌CCK從而刺激膽囊運動，減少膽固醇結石產生。參苓白術散通過“腸-肝”軸途徑來緩解膽汁中膽固醇過飽和的情況，最終降低膽石癥發(fā)生率。

綜上所述，參苓白術散可以抑制小腸吸收膽固醇、減輕肝細胞對膽固醇攝取、促進膽囊運動，最終緩解膽汁膽固醇過飽和情況減少膽囊中膽固醇結石形成。推測上述效果主要是參苓白術散作用于“腸-肝”軸，即抑制上小腸上皮刷狀緣NPC1L1、肝細胞SIRB1，促進小腸分泌CCK作用于膽囊有關，但可能還有其他作用靶點，還需要進一步研究。