徐李玲， 黃艷萍， 郭殊瑋， 梁寶賢， 蔣偉哲， 付書婕

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的全身性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)的慢性炎癥、軟骨和關(guān)節(jié)骨的破壞為特征，表現(xiàn)為類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、肺間質(zhì)病變、Felty’s綜合征等一系列關(guān)節(jié)外表現(xiàn)[1-2]，是一種典型的慢性炎性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、滑膜增生、軟骨及骨破壞。目前，相關(guān)治療藥物包括非甾體類抗炎藥、甾體類抗炎藥、疾病修飾類抗風(fēng)濕藥、生物制劑、中藥[3]。NF-κB信號(hào)通路參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，它作為轉(zhuǎn)錄因子，通過激活和參與炎癥產(chǎn)生(如IL-1β、TNF-α等)來調(diào)節(jié)發(fā)病機(jī)理，從而影響本病炎癥進(jìn)展[4-6]。

八角楓為八角楓科八角楓屬植物AlangiumChinese(Lour)Harms，其味辛溫[7-8]，主要成分為生物堿，烯、醇醚類、苷類等[9-11]，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、平滑肌、呼吸系統(tǒng)均有良好的作用[12]。八角楓丸劑由廣西壯要方醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑室提供，具有鎮(zhèn)痛、消炎、抗風(fēng)濕、肌肉松弛的作用[13-14]，主要用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療。本實(shí)驗(yàn)建立膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型，研究八角楓丸劑抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性及其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(150±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(桂)2014-0002，溫度控制在(23±2)℃，相對(duì)濕度控制在(50±10)%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物 八角楓丸劑(批號(hào)20190730，廣西壯要方醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑室自制)；雷公藤多苷片(批號(hào)20190401，湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司)。

1.3 試劑 牛源性Ⅱ型膠原蛋白(批號(hào)190209，美國Chondrex公司)；弗氏不完全佐劑(批號(hào)SLBZ2765，美國Sigma公司)；羧甲基纖維素鈉CMC-Na(批號(hào)20180110，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；4%多聚甲醛溶液(批號(hào)P1110)、苯甲基磺酰氟化物PMSF(批號(hào)20190903)、RIPA裂解液(批號(hào)20190826)，均購自北京索萊寶科技有限公司；腫瘤壞死因子(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)、白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)ELISA試劑盒(批號(hào)均為20191220)，均購自于南京建成生物工程研究所；β-actin抗體(批號(hào)4970S)、Anti-rabbit IgG(H+L).(DyLightTM800 4×PEG Conjugate)(批號(hào)5151P)，均購自美國CST公司；NLRP3抗體(批號(hào)AB263899，英國Abcam公司)；TLR4抗體(批號(hào)ABS143411)、IRAK1抗體(批號(hào)ABS116547)，均購自上海愛必信生物科技有限公司。

1.4 儀器 冷凍離心機(jī)(MicroCL17R型，美國Thermo Fisher Scientific公司)；連續(xù)光譜掃描酶標(biāo)儀(SpectraMaxPlus384型，香港分子儀器公司)；電泳儀(PowerPac HC型，美國Bio-Rad公司)；Odyssey紅外熒光掃膜成像系統(tǒng)(LI-COROdyssey CLx型，美國LI-COR公司)。

2 方法

2.1 八角楓丸劑的制備 稱取八角楓適量，加入10倍量蒸餾水煎煮提取2次，每次1 h，合并濾液，濃縮成稠膏，蒸干為干膏，取適量加入輔料(CMS-Na和淀粉)和潤濕劑(水)制丸，干燥，即得。

2.2 造模 將溶解于冰醋酸的牛源性Ⅱ型膠原蛋白加入等體積的弗式不完全佐劑，在冰浴條件下使兩者充分乳化(以乳化液滴入水中不擴(kuò)散為度)，使用高速勻漿機(jī)充分混合均勻，轉(zhuǎn)速設(shè)置為3 000 r/min，時(shí)間間隔3 min，其間適時(shí)更換冰水混合物，保持離心管溫度在4 ℃左右，以免膠原變性，乳劑最終狀態(tài)應(yīng)充分混勻，呈油包水狀。若未達(dá)到此效果需重復(fù)上述操作過程，最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL。在大鼠尾根部及足恥底部注射牛源性Ⅱ型膠原蛋白乳劑各0.1 mL，初次免疫后第7天，在大鼠尾根部、背部以相同劑量再次免疫[15]。

2.3 分組及給藥 造模成功后，將大鼠分為模型組、八角楓丸劑高(84 mg/kg)和低(21 mg/kg)劑量組、陽性藥(15 mg/kg雷公藤多苷)組、空白組，按10 mL/kg劑量灌胃給藥，模型組、空白組大鼠灌胃給予等量0.5%的CMC-Na，連續(xù)28 d。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)

2.4.1 足厚度 分別于致炎前(第0天)和致炎后第14、21、28、35、42天，用軟尺測(cè)量每只大鼠右后爪周長，游標(biāo)卡尺測(cè)量右足肉墊厚度。

2.4.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 參考文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道，于致炎前(第0天)和致炎后第14、21、28、35、42天進(jìn)行評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)為(1)0分，正常；(2)1分，踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹；(3)2分，踝關(guān)節(jié)到跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹；(4)3分，踝關(guān)節(jié)到跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹；(5)4分，踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹。

2.4.3 免疫器官指數(shù) 各組大鼠禁食12 h，末次給藥1 h后腹腔注射水合氯醛麻醉，分離脾臟和胸腺，稱定質(zhì)量，計(jì)算大鼠免疫器官指數(shù)，公式為脾臟或胸腺指數(shù)=(脾臟或胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量)×103。

2.4.4 血清炎癥因子水平 各組大鼠禁食12 h，末次給藥1 h后腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，采用ELISA法檢測(cè)血清IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1水平。

2.4.5 組織病理學(xué) 大鼠脫頸處死，立即分離病變關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定48 h，10%EDTA脫鈣液脫鈣，以大頭針刺入踝關(guān)節(jié)局部無阻力感為脫鈣完全，HE染色后，于顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化及評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)為(1)滑液損傷，無損傷0分，輕度損傷1分，中度損傷或增生2分，嚴(yán)重破壞3分；(2)炎性浸潤，無炎癥0分，輕度浸潤1分，溫和的滲透2分，嚴(yán)重的滲透3分；(3)軟骨破壞，無損傷0分，輕度破壞1分，中度破壞2分，嚴(yán)重破壞伴有軟骨丟失或完全碎裂3分；(4)骨破壞，無損傷0分，輕度軟骨下骨質(zhì)破壞1分，中度骨質(zhì)破壞2分，骨破壞嚴(yán)重伴有大面積骨丟失3分；(5)骨贅形成，無0分，輕微形成1分，中等形成2分，廣泛形成3分[18]。

2.4.6 Western blot法 給藥4周后，麻醉處死各組大鼠，取下踝關(guān)節(jié)滑膜組織，用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液裂解蛋白，加緩沖液，沸水浴5 min變性，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜1.5 h，5% BSA封閉液封閉1 h，孵育一抗，4 ℃過夜，二抗孵育1 h，掃膜，通過Image J軟件檢測(cè)蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 足厚度 造模后14 d，與空白組比較，模型組、陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠足厚度增大(P<0.01)；造模后21～42 d，與模型組比較，陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠足厚度減小(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 八角楓丸劑對(duì)大鼠足厚度的影響

3.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 造模后14～42 d，與空白組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高(P<0.01)；造模后21～42 d，與模型組比較，陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 八角楓丸劑對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響(分，

3.3 臟器指數(shù) 與空白組比較，模型組大鼠脾臟、胸腺指數(shù)升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠脾臟、胸腺指數(shù)降低(P<0.01)，見表3。

表3 八角楓丸劑對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響

3.4 血清炎癥因子水平 與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、TGF-β1水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠血清TNF-α、IL-1β、TGF-β1水平降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.01)，見表4。

表4 八角楓丸劑對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-10、IL-1β、TGF-β1水平的影響

3.5 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué) 空白組大鼠滑膜組織細(xì)胞形態(tài)完整，無炎性細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨無損傷，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織增生，滑膜下組織血管擴(kuò)張，部分滑膜組織纖維化，有血管翳形成，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤；陽性藥物組大鼠病理切片顯示關(guān)節(jié)面光滑，但細(xì)胞形態(tài)改變，有纖維化痕跡；八角楓丸劑低劑量組效果不理想，而高劑量組大鼠細(xì)胞排列整齊，視野內(nèi)滑膜細(xì)胞增生減少，有少量炎性細(xì)胞浸潤，未見血管翳，與模型組比較病理變化明顯，見圖1、表5。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)(×100)

表5 八角楓丸劑對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響(分，

3.6 NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá) 與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、八角楓丸劑組NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，見圖2、表6。

表6 八角楓丸劑對(duì)大鼠滑膜組織NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá)的影響

圖2 各組大鼠滑膜組織NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá)

4 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，主要累及關(guān)節(jié)，引起增殖性滑膜炎。其特點(diǎn)是大量炎性細(xì)胞浸潤，形成血管翳，滑膜擴(kuò)張，侵犯鄰近關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨，與腫瘤相似，造成損傷[19-20]。NF-κB信號(hào)通路參與各種炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生[21-22]。NF-κB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中包括兩個(gè)主要機(jī)制，首先NF-κB的激活能增加炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，反過來，這些炎癥介質(zhì)可以激活NF-κB的表達(dá)；兩者都構(gòu)成正反饋機(jī)制，導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥介質(zhì)[23]。

本研究結(jié)果顯示，八角楓丸劑能降低大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)，能緩解大鼠的足趾紅腫，表明八角楓丸劑能較好的抑制RA大鼠的炎癥癥狀。通過病理學(xué)分析可以知道八角楓丸劑組大鼠細(xì)胞排列整齊，視野內(nèi)滑膜細(xì)胞增生減少，有少量炎性細(xì)胞浸潤，未見血管翳。與模型組比較，病理改變明顯。由此可看出，八角楓丸劑對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有良好的治療作用。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，根據(jù)相關(guān)研究顯示，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病變過程中，會(huì)使關(guān)節(jié)積液與滑膜組織中T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，進(jìn)而促進(jìn)多種炎癥因子的分泌，炎癥因子是關(guān)鍵功能分子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中影響發(fā)病和進(jìn)展的主要原因之一[24]，包括TNF-α、IL-6和IL-1β[25]。其中IL-1β在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。研究表明，IL-1β主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，IL-1β可以激活單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞粘附分子，趨化因子和其他炎癥介質(zhì)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥加劇[26]。本文研究顯示，八角楓丸劑可以降低大鼠血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1水平，升高IL-10水平，提示八角楓丸劑可能通過減少炎癥因子的產(chǎn)生從而減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹炎癥反應(yīng)來發(fā)揮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。說明降低炎癥因子的水平可能是八角楓丸劑抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的一部分。

NF-κB信號(hào)通路作為參與炎癥反應(yīng)的最關(guān)鍵的信號(hào)通路，其密切作用于慢性疾病的發(fā)展過程。NF-κB有能力控制基因產(chǎn)物的表達(dá)影響多種細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。該信號(hào)通路可刺激滑膜的新生血管生成和炎癥反應(yīng)[27-28]。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，八角楓丸劑能下調(diào)NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá)水平，說明八角楓丸劑抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制與抑制NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上，八角楓丸劑對(duì)牛源性Ⅱ型膠原蛋白所致的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有良好的治療作用，其機(jī)制與抑制炎癥因子的產(chǎn)生和下調(diào)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平有關(guān)。