李思媛， 崔玉順， 李新星， 何 佳， 唐紅珍， 楊世林， 高紅偉*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西優(yōu)勢(shì)中成藥與民族藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)中心，廣西 南寧 530020)

炎癥是對(duì)入侵病原體，受損細(xì)胞和刺激物的自我保護(hù)反應(yīng)[1]，實(shí)質(zhì)上也是指機(jī)體與致炎因子進(jìn)行斗爭(zhēng)的反應(yīng)，在整個(gè)炎癥過(guò)程中這種斗爭(zhēng)反映會(huì)一直存在于機(jī)體各部分組織和器官，常見(jiàn)的有扁桃體炎、肺炎、肝炎、腎炎等，過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)人體產(chǎn)生損傷，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致中風(fēng)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等[2]。炎癥根據(jù)其性質(zhì)可分為急性和慢性，當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)刺激時(shí)首先會(huì)產(chǎn)生急性炎癥，伴隨著等離子和粒細(xì)胞從血液運(yùn)輸?shù)搅耸軗p組織，然后血管和免疫系統(tǒng)對(duì)受損組織作出免疫應(yīng)答，進(jìn)一步開(kāi)始釋放炎癥介質(zhì)，從而誘發(fā)急性炎癥進(jìn)入慢性期[1]。因此，關(guān)于炎癥作用機(jī)制的研究對(duì)其引起相關(guān)疾病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。

黃精化學(xué)成分包括皂苷、多糖、黃酮、生物堿等，目前對(duì)多糖的研究最廣泛[3]，但鮮有涉及皂苷。以往研究顯示，其他植物皂苷都具有抗炎、抗腫瘤、抗真菌等作用[4-5]，其中從黃精中分離出的甾體皂苷可抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌NO、TNF-α，具有一定的抗炎作用，但該成分對(duì)炎癥反應(yīng)作用的確切藥理機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以RAW264.7細(xì)胞為對(duì)象，研究黃精皂苷通過(guò)NF-κB/MAPKs信號(hào)通路發(fā)揮體外抗炎作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 藥材 黃精購(gòu)于廣西臨山殿中草藥種植有限公司，經(jīng)蘇州大學(xué)李笑然教授鑒定為正品。取粗粉100 g，1 L甲醇浸提18 h后于30～40 ℃下超聲1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至無(wú)醇味，加入適量純水混懸，乙酸乙酯萃取，濃縮萃取液，除去溶劑，即得黃精提取物，黃精皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84%。

1.2 細(xì)胞與試劑 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基(2327860)、胎牛血清(2176404)、PBS(2200918)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒(TE266615)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；GAPDH(8884S)、NF-κB/p65(8242S)、iNOS(2977S)、COX-2(4842S)、IKKα(2682S)、IKKβ(8943S)、IκBα(4814S)、p-IKKα/β(2697S)、p-IκBα(2859S)、P-NF-κB/p65(3033S)、p38(9212S)、ERK(4370S)、JNK(9252S)、p-p38(4511S)、p-ERK(4370S)、p-JNK(4668S)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(100918190307)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；小鼠TNF-α(M200115-102a)、IL-6(M210125-004a)ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司；ROS試劑盒(1630212)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及貯存液配制 RAW264.7細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 d傳代1次。黃精皂苷浸膏溶于DMSO配制成20 mg/mL貯存液，避光-20 ℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(DMSO終體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)0.1%)。

2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性 將RAW264.7細(xì)胞按照每孔5×104個(gè)的密度接種于96孔板中過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入用1%培養(yǎng)基配制好的不同質(zhì)量濃度黃精皂苷(20、40、80、100 μg/mL)藥液，培養(yǎng)細(xì)胞24 h，加入MTT工作液，避光于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，每孔加入DMSO 100 μL，室溫避光，于搖床上搖晃溶解結(jié)晶，多功能微孔板檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD)值。細(xì)胞存活率=(OD給藥組/OD空白組)×100%

2.3 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞以每孔5×104個(gè)的密度接種于96孔板中過(guò)夜培養(yǎng)，將細(xì)胞分為空白組、模型組、給藥組，給藥組用不同質(zhì)量濃度黃精皂苷預(yù)處理細(xì)胞1 h，LPS誘導(dǎo)炎癥模型。

2.3.1 上清培養(yǎng)液NO水平 模型組和給藥組給予LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)刺激18 h。各組吸取50 μL上清培養(yǎng)液至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入50 μL Griess試劑，輕輕搖晃使其充分混勻，在37 ℃下放置反應(yīng)30 min后，多功能微孔板檢測(cè)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度。

2.3.2 上清培養(yǎng)液TNF-α、IL-6水平 模型組和給藥組給予LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)刺激18 h，取上清培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)黃精皂苷對(duì)TNF-α、IL-6釋放的影響。

2.4 JC-1熒光染色法檢測(cè)胞內(nèi)線粒體膜電位(MMP)水平 LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)誘導(dǎo)8 h，棄去孔中液體，加入含JC-1染色液的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，孵育完成后加入100 μL冰PBS洗滌細(xì)胞，棄去液體后每孔加入100 μL PBS，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.5 活性氧(ROS)釋放檢測(cè)

2.5.1 流式細(xì)胞儀 將RAW264.7細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)的密度接種于24孔板過(guò)夜培養(yǎng)，將細(xì)胞分為空白組、模型組、給藥組，給藥組用黃精皂苷(20、40、80 μg/mL)預(yù)處理1 h后，LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)誘導(dǎo)8 h，將ROS探針DCFH2-DA(10 μg/mL)加入96孔板中，在37 ℃下避光孵育30 min，冰PBS清洗細(xì)胞1次，加入冰胰酶進(jìn)行消化后加入300 μL冰PBS將細(xì)胞沖洗下來(lái)，收集到流式管中，上機(jī)檢測(cè)。

水稻紋枯病俗稱“爛腳病”“花腳桿”，苗期至穗期都可發(fā)病。濕度低時(shí)葉鞘中部組織破壞呈半透明狀，邊緣暗褐，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)病斑融合形成大病斑，呈不規(guī)則狀云紋斑，致葉片發(fā)黃枯死。葉片上的病斑呈云紋狀，邊緣褪黃，發(fā)病快時(shí)病斑呈污綠色，葉片很快腐爛。莖稈受害癥狀似葉片，后期呈黃褐色，易折。穗頸部受害常不能抽穗，抽穗的秕谷較多，千粒重下降。高溫條件下病斑上產(chǎn)生一層白色粉霉層，即病菌的擔(dān)子和擔(dān)孢子［3］。

2.5.2 ROS試劑盒 RAW264.7細(xì)胞以每孔5×104個(gè)的密度接種于96孔板中過(guò)夜培養(yǎng)，將細(xì)胞分為空白組、模型組、給藥組，給藥組用黃精皂苷(20、40、80 μg/mL)預(yù)處理細(xì)胞1 h，LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)誘導(dǎo)8 h，誘導(dǎo)完成后棄去上清液，按照ROS檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行ROS檢測(cè)。

2.6 Western Blot法檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白表達(dá) RAW264.7細(xì)胞以每孔6×105個(gè)的密度接種于6孔板過(guò)夜培養(yǎng)，將細(xì)胞分為空白組、模型組、給藥組，給藥組用黃精皂苷(20、40、80 μg/mL)預(yù)處理1 h后，LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)分別誘導(dǎo)8、24 h，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞置于冰上，棄掉培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，加入適量蛋白裂解液，裂解10 min后細(xì)胞刮將其刮下來(lái)收集于1.5 mL EP管，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，取上清，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，酶標(biāo)儀于562 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其光密度，蛋白樣品中加入5×SDS-PAGE Loading buffer，于97 ℃金屬浴中煮沸7 min使蛋白變性，10%SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)于PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h后，分別使用iNOS、COX-2、IKKα、IKKβ、p-IKKα/β、IκBα、p-IκBα，NF-κB/p65、p-p65、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、GAPDH的抗體(1∶1 000)于4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，二抗在室溫下孵育2 h，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光法顯影。

3 結(jié)果

3.1 黃精皂苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響 RAW264.7細(xì)胞用黃精皂苷藥液處理24 h后，存活率沒(méi)有受到抑制，說(shuō)明黃精皂苷(20、40、80 μg/mL)對(duì)RAW264.7細(xì)胞不具有毒性，見(jiàn)圖1。

注：與空白組比較，#P<0.05。

3.2 黃精皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響 由圖2可知，與空白組比較，模型組NO水平增加(P<0.01)；與模型組比較，黃精皂苷3個(gè)劑量組NO水平減少(P<0.01)，表明黃精皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO具有抑制作用。

注：與空白組比較，##P<0.01；與LPS組比較，**P<0.01。

3.3 黃精皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-6、TNF-α釋放的影響 圖3表明，與空白組比較，模型組IL-6、TNF-α釋放增多(P<0.01)；與模型組比較，黃精皂苷40、80 μg/mL組IL-6釋放減少(P<0.05、P<0.01)，80 μg/mL組TNF-α釋放減少(P<0.05)，說(shuō)明黃精皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-6、TNF-α釋放具有抑制作用。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與LPS組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.4 黃精皂苷對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)的影響 如圖4所示，與空白組比較，模型組中LPS破壞了線粒體膜電位的穩(wěn)定性，JC-1單體(綠色熒光)增加；黃精皂苷預(yù)處理后，JC-1單體降低，聚合體(紅色熒光)增加，表明黃精皂苷可維持線粒體膜電位的穩(wěn)定。

圖4 MMP顯微熒光圖(×10)

3.5 黃精皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的影響 如圖5所示，模型組ROS生成增加(P<0.01)；與模型組比較，黃精皂苷80 μg/mL組ROS產(chǎn)生減少(P<0.05)。ROS試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組ROS生成增加(P<0.05)；與模型組比較，黃精皂苷3個(gè)劑量組ROS產(chǎn)生有所減少(P<0.05)，表明黃精皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的ROS具有抑制作用。

注：A為ROS流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，B為 ROS試劑盒檢測(cè)結(jié)果。與空白組比較，##P<0.01；與LPS組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.6 黃精皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2表達(dá)的影響 如圖6所示，與空白組比較，模型組iNOS、COX-2的表達(dá)增加(P<0.01)；與模型組比較，給藥組iNOS、COX-2表達(dá)減少(P<0.01)，表明黃精皂苷對(duì)兩者表達(dá)具有抑制作用。

注：A為iNOS及COX-2蛋白表達(dá)圖，B～C為iNOS及COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖。與空白組比較，##P<0.01；與LPS組比較，**P<0.01。

3.7 黃精皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的影響 如圖7所示，1 μg/mL LPS作用于RAW264.7細(xì)胞8 h后，NF-κB p65磷酸化蛋白(p-p65)、IKKα/β磷酸化蛋白(p-IKKα/β)、IκBα磷酸化蛋白(p-IκBα)表達(dá)提高(P<0.01)；與模型組比較，不同質(zhì)量濃度黃精皂苷均可以降低磷酸化蛋白的表達(dá)(P<0.01)，說(shuō)明黃精皂苷能在一定程度上降低RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中NF-κB信號(hào)通路磷酸化蛋白的表達(dá)，而且在不同劑量下對(duì)IκBα總蛋白的降解具有抑制作用。

注： A為NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)圖，B～D為p-IKKα/β、p-IκBα、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖。與空白組比較，##P<0.01；與LPS組比較，**P<0.01。

3.8 黃精皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的影響 如圖8所示，1 μg/mL LPS作用于RAW264.7細(xì)胞8 h后，ERK磷酸化蛋白(p-ERK)、JNK磷酸化蛋白(p-JNK)、p38磷酸化蛋白(p-p38)的表達(dá)提高(P<0.01)；與模型組比較，不同質(zhì)量濃度的黃精皂苷均可以降低磷酸化蛋白的表達(dá)(P<0.01)，說(shuō)明黃精皂苷能在一定程度上降低RAW264.7炎癥細(xì)胞模型中MAPK信號(hào)通路磷酸化蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。

注：A為MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)圖，B～D為p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖。與空白組比較，##P<0.01；與LPS組比較，**P<0.01。

4 討論

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7是其機(jī)體抗炎免疫以及防御的主要成員[6]，在炎癥過(guò)程中會(huì)分泌炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)[7]，常用于細(xì)胞生物學(xué)研究。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜主要成分之一，多用于建立炎癥模型[8-10]。LPS可以促使很多細(xì)胞模型大量釋放炎癥介質(zhì)及因子如NO,PGE2,IL-6,IL-1β和TNF-α等[10]，特別是對(duì)于巨噬細(xì)胞模型。一氧化氮是一種與多種免疫病理變化相關(guān)的反應(yīng)性自由基。經(jīng)LPS刺激，RAW264.7細(xì)胞中的iNOS過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致一氧化氮大量產(chǎn)生，從而觸發(fā)多重炎癥病理反應(yīng)。COX-2是COX同工酶中的一種，是介導(dǎo)炎癥的關(guān)鍵酶[1]。過(guò)度分泌的細(xì)胞因子IL-6和TNF-α是重要的炎癥介質(zhì)[11-12]。黃精皂苷抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS、COX-2表達(dá)，以及亞硝酸鹽，IL-6的產(chǎn)生，其高濃度對(duì)TNF-α的釋放具有抑制作用。LPS刺激巨噬細(xì)胞之后，其產(chǎn)生的活性氧(ROS)顯著增高，線粒體的膜電位也明顯降低[13]。過(guò)多的ROS產(chǎn)生可能會(huì)通過(guò)降低線粒體膜電位從而損傷線粒體，而黃精皂苷對(duì)ROS生成有抑制作用，對(duì)MMP的降低有抑制作用，結(jié)果表明其對(duì)線粒體具有一定的保護(hù)作用。

NF-κB是該家族的核轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子等各種外界刺激的響應(yīng)，在細(xì)胞的炎癥及免疫應(yīng)答等過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用[1,14-17]。NF-κB通過(guò)IKK刺激IκB從而被激活。激活的p65從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合[18]，導(dǎo)致一連串促炎性靶因子轉(zhuǎn)錄，其中包括IL-6，TNF-α，iNOS等。黃精皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的磷酸化的IKKα/β、IκBα和p65蛋白表達(dá)有抑制作用，這表明NF-κB通路可能是它的抗炎作用機(jī)制之一。MAPKs通路調(diào)控從增殖分化到細(xì)胞凋亡等多種過(guò)程[19-20]，也積極參與免疫防御和炎癥反應(yīng)，該通路主要有ERK、p38和JNK三條途徑[21]，特別是p38途徑，是炎性介質(zhì)合成的主要途徑之一，因此被認(rèn)為是抗炎藥物的重要靶點(diǎn)。在LPS刺激的蛋白中，黃精皂苷對(duì)磷酸化的p38MAPK和JNK、ERK蛋白表達(dá)也具有抑制作用，這表明它們也可能參與了黃精皂苷的抗炎作用。

綜上所述，黃精皂苷可以抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB、MAPKs信號(hào)通路有關(guān)，更深入的機(jī)制及作用有效成分的確認(rèn)，還有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。