王小龍
(阜陽市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,安徽 阜陽 236000)
國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示,2015年我國新增癌癥患者392.9萬,并有233.8萬人死亡,其中肺癌發(fā)病和死亡人數(shù)均居惡性腫瘤第1位,它是我國最常見的癌癥,也是導致癌癥死亡的首要原因[1-2]。中醫(yī)并無“肺癌”病名,相關(guān)論述多散見于歷代關(guān)于“肺積”“息賁”“咳嗽”“咯血”“痞癖”“胸痛”“癥瘕積聚”等記載[3],對肺癌的認識較早,相關(guān)治則治法亦有多種,以“母病及子”“脾虛痰聚于肺”為理論的培土生金法在治療肺癌方面具有一定的特色和優(yōu)勢。本研究借助TCMISS平臺及網(wǎng)絡(luò)藥理學相關(guān)數(shù)據(jù)庫,從阜陽市中醫(yī)醫(yī)院處方切入,篩選治療肺癌的新處方,并分析培土生金法治療肺癌的組方規(guī)律及分子機制,闡釋中醫(yī)藥治法理論內(nèi)涵,并為臨床用藥提供參考。
1.1 處方來源 2019年度阜陽市中醫(yī)醫(yī)院中藥房診斷為肺癌、肺惡性腫瘤個人史的門診中藥處方,經(jīng)篩選后共納入86張,均由阜陽市中醫(yī)醫(yī)院門診部、國醫(yī)堂專家開具,具有一定的代表性。
1.2 數(shù)據(jù)預處理 由于歷史演變、各地習慣等因素,導致中藥名稱混亂,同藥異名、同名異藥現(xiàn)象普遍存在,給臨床及科研工作帶來諸多不便[4]。為便于統(tǒng)計,降低分析結(jié)果的偏差,本研究參考2015版《中國藥典》[5]、高等院?!吨兴帉W》[6]教科書(作為藥物一級和二級功效、性味、歸經(jīng)分類的文獻依據(jù))《常用中藥別名速查手冊》[7],對藥名進行規(guī)范化處理,其余保證藥名一致即可,中藥拉丁名參考《中藥鑒定學》[8]教材及南京中醫(yī)藥大學中藥標本中心(Chinese medicine specimen center of Nanjing University of Chinese Medicine,http://zybb.njucm.edu.cn/)進行規(guī)范。
1.3 數(shù)據(jù)挖掘研究及新處方篩選 將86張?zhí)幏街械乃幬镏鹨讳浫胫嗅t(yī)傳承輔助平臺(TCMISS-V2.5,Traditional Chinese medicine inheritance support system)軟件,建立肺癌中藥處方數(shù)據(jù)庫。進入“數(shù)據(jù)分析”系統(tǒng),方劑類別選擇“肺癌”,使用“頻次統(tǒng)計”模塊對藥物使用頻率進行統(tǒng)計,并參照《中藥學》教科書對頻次>2次中藥的功效、性味、歸經(jīng)進行分類。應(yīng)用Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則分析模塊,在置信度為0.8條件下,將支持度個數(shù)調(diào)至26、21、17,分別展示由核心到外圍的藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則。采用熵層次聚類分析方法,設(shè)置相關(guān)度為6,懲罰度為5,基于復雜系統(tǒng)熵聚類以及無監(jiān)督的熵層次聚類得出用于新方聚類的4條藥物組合,并演化出2首用于治療肺癌的新處方。本研究擬對方二進行進一步的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析,以探討其治療肺癌的分子機制。
1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析 進入中藥分子機制在線分析工具(BATMAN-TCM,a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/),選擇Example-2模塊,在Score cutoff為35、AdjustedP-value為0.05條件下,篩選新方活性分子及相應(yīng)基因。同時以“l(fā)ung cancer”為檢索詞,在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https://www.genecards.org/)尋找支氣管肺癌相關(guān)基因。依據(jù)基因數(shù)量,保留打分≥30的基因進行分析。在Venny-2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)平臺導入新處方相應(yīng)基因(去重后)及肺癌相關(guān)基因,通過取兩者交集,預測新處方治療肺癌的靶基因。同時將預測得到的靶標匹配新方活性分子,建立活性分子-潛在靶基因?qū)?yīng)關(guān)系,并導入Cytoscape 3.7.0構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。使用STRING(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶基因PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò),同時應(yīng)用Cytoscape軟件對核心網(wǎng)絡(luò)進行分析。將Degree值>10的16個核心靶標導入Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)數(shù)據(jù)庫進行靶標途徑和通路富集總分析[9],應(yīng)用David(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對GO功能及KEGG代謝通路進行進一步的深入分析。
2.1 數(shù)據(jù)挖掘研究 86張?zhí)幏街泄灿弥兴?58味,合計1 479味次。使用頻次≥30次的有12味,前5味分別為半夏、甘草、薏苡仁、白術(shù)、砂仁,出現(xiàn)頻次均>40次。使用頻次≥30次的中藥見表1,根據(jù)藥物數(shù)量,對出現(xiàn)頻次>2次者進行一級、二級功效分類,見表2。在四氣五味方面,以溫性、平性、微寒及甘、辛、苦味較多;在歸經(jīng)方面,以歸肺、脾、胃經(jīng)最多,見表3。本研究在置信度0.8條件下,分別設(shè)置支持度個數(shù)為26、21、17,隨著支持度個數(shù)的降低,逐漸出現(xiàn)由核心到外圍的藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則。如支持度個數(shù)為26時的款冬花-甘草、白術(shù)-半夏,支持度個數(shù)為21時的款冬花-桂枝、白術(shù)-黃芪、紫菀-干姜,支持度個數(shù)為17時的款冬花-干姜-桂枝等,見圖1。在Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則分析的基礎(chǔ)上,將相關(guān)度設(shè)置為6,懲罰度設(shè)置為5,聚類出4條用于新方組合的藥組,見表4。通過對4條中藥組合進一步整理,得出2首治療支氣管肺癌的新處方。
表4 新方聚類組合(相關(guān)度6,懲罰度5)
圖1 中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則(置信度0.8)
表1 使用頻次≥30次的前12味中藥
表2 使用頻次>2次的中藥功效分布
表3 中藥四氣、五味、歸經(jīng)分布(使用頻次>2次)
2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學研究 本研究擬對圖2中的新處方二(白術(shù)-干姜-桂枝-款冬花)進行網(wǎng)絡(luò)藥理學研究。在BATMAN-TCM平臺搜集新處方活性分子,去除缺乏結(jié)構(gòu)信息和靶標預測項,共整理出新方活性分子66個,包含白術(shù)4個,干姜37個,桂枝14個,款冬花11個,見表5;活性分子相應(yīng)基因分別為白術(shù)26條,干姜739條,桂枝208條,款冬花147條,共獲得新處方相應(yīng)基因1 120條,去重后290條。在Genecards數(shù)據(jù)庫搜集肺癌相關(guān)基因22 399個,其中打分≥30的有614條。將614條肺癌基因與290條新處方基因取交集,獲得交集基因34個,見圖3。將34個交集基因匹配中藥活性分子并導入Cytoscape軟件,得到活性分子-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖,共90個節(jié)點,166條邊,其中內(nèi)圈為相應(yīng)基因,外圈散點為活性分子,見圖4。使用STRING、Cytoscape構(gòu)建靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò),共34個節(jié)點,174條邊,平均節(jié)點度值10.2,局部集聚系數(shù)0.616,見圖5。進一步分析其核心網(wǎng)絡(luò)節(jié)點,篩選Degree值>10的16條核心蛋白節(jié)點用于進一步的GO功能及KEGG代謝通路富集分析,見圖6、表6。使用Metascape數(shù)據(jù)庫對核心靶標進行熱圖富集總分析,基因組中的所有基因都被用于富集背景,依據(jù)P<0.01、最小計數(shù)為3、富集因子>1.5收集相關(guān)項,并根據(jù)其相似度進行分組,將前19條具代表性的富集結(jié)果予以展示,見圖7。根據(jù)DAVID分析結(jié)果,核心靶標主要參與的生物過程(BP)共25條,其中P<0.05的有21條;細胞組分(CC)共3條,其中P<0.05的有2條;分子功能(MF)共10條,其中P<0.05的有8條,見圖8。KEGG代謝通路分析顯示34條,其中P<0.05的有27條,見圖9。
圖7 Metascape生物途徑及通路富集總分析
圖8 GO富集分析
圖9 KEGG通路富集分析
表6 新處方二中核心靶標(度值>10)
圖2 治療肺癌新處方(相關(guān)度6,懲罰度5)
圖3 肺癌靶基因韋恩圖
圖4 活性分子-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖
圖5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)
圖6 PPI核心網(wǎng)絡(luò)節(jié)點
表5 新處方二中4味藥材活性分子
中醫(yī)歷來重視痰飲與腫瘤間的關(guān)系,因腫瘤是全身疾病的局部表現(xiàn),肺癌的發(fā)生亦與痰飲相關(guān)。津液代謝障礙,痰氣郁結(jié)阻滯中焦氣機,久則痰飲內(nèi)停,聚結(jié)于肺,發(fā)為腫瘤[10],故痰飲可能是肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。治法方面,當以甘、溫之藥為主。以甘溫除痰飲,蓋因肺為貯痰之器,然脾乃生痰之源。古有仲景之黃芪建中湯治肺虛損不足,創(chuàng)甘溫培土法;又有東垣謂脾胃一虛,肺氣先絕,創(chuàng)甘溫健脾之法[11]。
培土生金是古代五行學說在中醫(yī)治法方面的具體應(yīng)用,根據(jù)“虛則補其母”“其標在肺……其制在脾”等理論,從脾胃入手,通過健脾胃使得肺氣充實,土旺則金自生[12]。中醫(yī)培土生金法在祛邪的同時更加注重扶正的作用,從病因的角度看待疾病的發(fā)展,扶助正氣,激發(fā)患者自愈潛能,不失為治療肺癌的重要思路[13]。中西并舉,遵循“認病辨證”的原則,充分發(fā)揮現(xiàn)代醫(yī)學精準定性、定位,局部腫瘤控制率高的優(yōu)勢,結(jié)合中醫(yī)培土生金的診療特色,可極大改善患者的臨床獲益[14]。尤其在緩解臨床癥狀[15]、防治復發(fā)轉(zhuǎn)移[16]、治療癌因性疲乏[17]、以及對化療藥的減毒增效[18]等方面均體現(xiàn)其獨到的優(yōu)勢,值得進一步深入研究。
在宏觀層面,本研究從86張肺癌處方中過濾出半夏、甘草、薏苡仁、白術(shù)、砂仁等高頻藥物。以化痰止咳平喘、補虛、清熱、利水滲濕、化濕等藥物為主,包含了補氣、清熱解毒、止咳平喘、清化熱痰、利水消腫、溫化寒痰、補陰等二級功效。通過進一步分析,發(fā)現(xiàn)本院治療肺癌的中藥性味以甘溫為多,主入肺、脾、胃經(jīng)。進一步應(yīng)用Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則分析,從核心到外圍全面展示了本院治療支氣管肺癌的用藥規(guī)律。通過熵層次聚類分析,得出“大棗-魚腥草-山慈菇”“款冬花-桂枝-干姜”“黨參-白花蛇舌草-重樓-半枝蓮”“款冬花-白術(shù)-干姜”四條核心藥組。經(jīng)進一步整合,篩選出2首治療肺癌的新處方,皆有脾肺同治之意。尤其新處方二,桂枝-白術(shù)能化氣健脾,干姜-白術(shù)善溫中化飲,伍以款冬花溫肺化痰,四藥合用,發(fā)揮健脾溫肺、培土生金的功效。本研究對處方“白術(shù)-干姜-桂枝-款冬花”進行進一步的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析,闡釋該方培土生金治療肺癌的分子機制。
從“宏觀到微觀”角度看,脾胃為氣機之樞、居中央以灌四旁,脾胃在人體的特殊地位決定了其對生命調(diào)控的特殊作用[19]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展一直伴隨著分子、細胞與宿主-腫瘤微環(huán)境的相互修飾,中醫(yī)藥改善調(diào)節(jié)宿主-腫瘤微環(huán)境的作用,可能是其抗腫瘤的最終作用機制[20]。本研究結(jié)果顯示,新處方“白術(shù)-干姜-桂枝-款冬花”治療肺癌具有多靶點-多通路-整合調(diào)節(jié)的特點,其培土生金的實質(zhì)內(nèi)涵可能主要通過影響能量代謝而發(fā)揮“補脾”“培土”的功效,通過作用于細胞因子及炎癥介質(zhì)等發(fā)揮“溫肺”“生金”的作用。一方面,脾胃居中焦,主運化,為“后天之本”“氣血生化之源”“氣機升降之樞”,脾胃的這些功能特點決定了其與細胞能量代謝的密切關(guān)系[21-23]。腫瘤細胞不但可以盡可能多地吸收和利用周圍的營養(yǎng)物質(zhì),而且可以根據(jù)微環(huán)境的改變選擇更有利的代謝方式[24]?;罨腁MPK可以增強分解代謝,抑制合成代謝,應(yīng)對細胞內(nèi)外環(huán)境的刺激,并且影響細胞的生長、增殖、凋亡、自噬等基本生物學過程,廣泛影響腫瘤的發(fā)生、生長,發(fā)揮重要的腫瘤拮抗作用[25]。另一方面,細胞因子在腫瘤細胞的發(fā)生及發(fā)展過程中扮演重要角色[26]。首先,有研究[27]提示血清 TNF-α、IL-1β等炎性細胞因子可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展,且與NSCLC的病理進程和預后密切相關(guān)。IFNG基因編碼的干擾素-γ(IFN-γ) 在病毒和細菌感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,IFNG基因rs2069705位點可能與肺癌風險具有相關(guān)性[28]。HIF-1α的高表達與NSCLC臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),而CXCR4作為HIF-1α的下游因子之一,兩者通過相互調(diào)控促進腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移[29]。其次,INS的高低或與肺癌的發(fā)展有關(guān)。盡管糖尿病和肺癌之間存在諸多混雜因素,其對肺癌影響的詳盡機制仍需大量研究深入證實[30]。但胰島素抵抗和高胰島素血癥的代償可通過INS及IGF-1受體的激活而發(fā)揮促進腫瘤生長的作用[31]。IGF-1在胰島素受體介導的信號轉(zhuǎn)導中起重要作用[32]。其可能通過自分泌和旁分泌等方式作用于肺癌細胞,并通過AKT信號通路促進人肺癌A549細胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[33-34]。此外,MMP9[35]、SERPINE1(PAI-1)[36]表達的上調(diào)亦與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
綜上所述,本研究從阜陽市中醫(yī)醫(yī)院86張肺癌處方中篩選出以“白術(shù)-干姜-桂枝-款冬花”組成的新處方,新處方甘溫護中、健脾溫肺,體現(xiàn)了培土生金的治則治法。這一治法的實質(zhì)內(nèi)涵可能與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡、免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)有關(guān)。其可能主要通過影響能量代謝、細胞因子及炎癥介質(zhì)等而作用于肺癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié),從而發(fā)揮培土生金的作用。