孫元芳， 劉輝見， 肖 雪， 張怡萍， 李莎莎， 嚴(yán)詩楷1,

(1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510006；3.山西太行藥業(yè)股份有限公司，山西 長治 046000；4.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006)

鼻炎是病毒、細(xì)菌、變應(yīng)原、各種理化因子以及某些全身性疾病引起的鼻腔黏膜炎癥，其臨床表現(xiàn)為鼻塞、多涕、嗅覺下降以及頭昏、頭痛等[1-2]。中醫(yī)理論認(rèn)為，鼻炎多由肺氣虛寒，衛(wèi)表不固，則腠理疏松，風(fēng)寒之邪或異氣易于乘虛而入。臨床常用桂枝湯加減方解肌發(fā)表，調(diào)和營衛(wèi)。

桂枝湯由桂枝、芍藥、生姜、大棗、甘草配伍而成。此方性溫味辛，既能溫肺，又能驅(qū)邪以通竅，同時(shí)調(diào)和營衛(wèi)以達(dá)到改善體質(zhì)的作用?，F(xiàn)代臨床研究表明桂枝湯通過減少鼻分泌物，保護(hù)鼻黏膜組織，減少血清中組胺、免疫球蛋白E(IgE)的表達(dá)[3]，抑制T輔助細(xì)胞2(Th2)的分泌功能，減少白介素4(IL-4)的釋放[4]，抑制嗜酸性粒細(xì)胞的聚集、活化[5]，緩解鼻炎癥狀。桂枝顆粒作為桂枝湯的現(xiàn)代制劑，也具有治療鼻炎的作用，但其治療鼻炎作用機(jī)制尚未見報(bào)道。

本研究擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度出發(fā)，預(yù)測桂枝顆粒治療鼻炎的藥效成分和潛在靶點(diǎn)，并通過基因本體(GO)功能分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路分析得到與桂枝顆粒治療鼻炎相關(guān)的信號通路和代謝途徑。本研究結(jié)果為揭示桂枝顆粒治療鼻炎的作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 桂枝顆粒藥效成分與靶點(diǎn)的收集 在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)中搜索白芍、甘草、桂枝、生姜、大棗中文名，得到的化學(xué)成分經(jīng)過去重合并，即為桂枝顆粒成分，篩選出同時(shí)滿足生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18者，即為潛在藥效成分。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫中藥效成分的“Related Targets”收集藥效成分相關(guān)靶點(diǎn)，采用Cytoscape3.7.0軟件對成分與靶點(diǎn)的關(guān)系進(jìn)行可視化處理。

1.2 鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)的獲取及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)搜索鼻炎英文名“rhinitis”，得到與鼻炎相關(guān)的基因。將疾病靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，進(jìn)行蛋白互作分析，并導(dǎo)出為.tsv文件。將文件中node1、node2信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.3 桂枝顆粒治療鼻炎的關(guān)鍵藥效成分和潛在靶點(diǎn)獲取 對桂枝顆粒藥效成分靶點(diǎn)與鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配分析，篩選出桂枝顆粒治療鼻炎潛在靶點(diǎn)，并根據(jù)潛在靶點(diǎn)與藥效成分的關(guān)系篩選出桂枝顆粒的關(guān)鍵藥效成分，整理它們與潛在靶點(diǎn)之間的關(guān)系，利用Cytoscape3.7.0軟件，構(gòu)建桂枝顆粒-關(guān)鍵藥效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 生物信息學(xué)分析 通過Cytoscape3.7.0軟件中的ClueGO插件，對桂枝顆粒治療鼻炎潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，構(gòu)建靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)。再導(dǎo)出結(jié)果，篩選合適的通路，與桂枝顆粒-關(guān)鍵藥效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)合并，建立桂枝顆粒-關(guān)鍵藥效成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 桂枝顆粒藥效成分與靶點(diǎn)的收集 桂枝顆粒藥效成分共有113種。從TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到其相關(guān)靶點(diǎn)267個(gè)，采用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建藥效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。圖1顯示，該網(wǎng)絡(luò)中共有380個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 084條邊，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.379，平均鄰居節(jié)點(diǎn)數(shù)為10.968，說明網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)間相關(guān)性較高。

注：代表藥效成分，代表靶點(diǎn)。

2.2 鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)的獲取及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 GeneCards數(shù)據(jù)庫中輸入rhinitis檢索鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)，得到1 415個(gè)基因。將靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscap3.7.0軟件對疾病靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)可視化，得到疾病靶點(diǎn)互作圖，見圖2。由此可知，該網(wǎng)絡(luò)共有412個(gè)節(jié)點(diǎn)，7 502條邊，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.393，平均鄰居節(jié)點(diǎn)數(shù)為36.417。

注：代表靶點(diǎn)。

2.3 桂枝顆粒治療鼻炎的關(guān)鍵藥效成分和潛在靶點(diǎn)獲取 桂枝顆粒治療鼻炎的潛在靶點(diǎn)共22個(gè)，分別為雄激素受體(AR)、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)、芳香烴受體(AHR)、過氧化氫酶(CAT)、CD40配體(CD40LG)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、雙氧化酶2(DUOX2)、表皮生長因子受體(EGFR)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶MU 1(GSTM1)、血紅素加氧酶1(HMOX-1)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)、γ干擾素(IFNγ)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、MAPK14、MAPK3、MAPK8、髓過氧化物酶(MPO)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、孕酮受體(PGR)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)，具體信息見表1。根據(jù)潛在靶點(diǎn)與藥效成分的關(guān)系，篩選出桂枝顆粒的關(guān)鍵藥效成分82種，包括黃酮類、萜類、香豆素、生物堿、植物甾醇，見表2。整理關(guān)鍵藥效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的關(guān)系，構(gòu)建關(guān)鍵藥效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖3。

表1 桂枝顆粒治療鼻炎的潛在靶點(diǎn)

表2 桂枝顆粒治療鼻炎潛在關(guān)鍵有效成分信息表

注：代表藥效成分，代表靶點(diǎn)。

2.4 生物信息學(xué)分析 利用Cytoscape3.7.0軟件中ClueGO插件對22個(gè)桂枝顆粒治療鼻炎潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，結(jié)果見圖4(Group00代表peptidyl-tyrosine autophosphorylation，Group01代表regulation of morphogenesis of a branching structure，Group02代表regulation of protein deacetylation，Group03代表nuclear receptor activity，Group04代表hydrogen peroxide metabolic process，Group05代表positive regulation of protein localization to cell periphery，Group06代表positive regulation of protein localization to plasma membrane，Group07代表negative regulation of lipid storage，Group08代表positive regulation of reactive oxygen species metabolic process，Group09代表reactive oxygen species biosynthetic process，Group10代表astrocyte differentiation)。在GO功能富集分析過程中，共確定了93條生物過程GO條目，主要涉及脂質(zhì)貯存、核受體活性、蛋白定位、細(xì)胞分化、氧化應(yīng)激等方面；通過KEGG通路富集分析，篩選P<0.05且至少匹配3個(gè)靶點(diǎn)基因的通路，共得到9條信號通路與桂枝顆粒治療鼻炎相關(guān)，其中TNF信號通路、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)信號通路、高親和力IgE受體(Fc epsilon RI)信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、IL-17信號通路、MAPK信號通路、Th17分化、松弛素(Relaxin)信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號通路與桂枝顆粒治療鼻炎的潛在作用機(jī)制相關(guān)，見圖5。將桂枝顆粒82種關(guān)鍵藥效成分、22個(gè)潛在作用靶點(diǎn)、9條信號通路關(guān)聯(lián)建立桂枝顆粒-關(guān)鍵藥效成分-潛在作用靶點(diǎn)-信號通路-鼻炎網(wǎng)絡(luò)，見圖6。

續(xù)表2

圖4 22個(gè)潛在靶點(diǎn)的GO功能富集分析

圖5 22個(gè)潛在靶點(diǎn)的KEGG通路分析

注：代表藥效成分，代表靶點(diǎn)，代表通路，代表鼻炎。

3 討論

3.1 桂枝顆粒治療鼻炎的潛在藥效成分 黃酮類、萜類、香豆素、生物堿、植物甾醇5大類成分可能是桂枝顆粒治療鼻炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。黃酮類成分包括槲皮素、山柰酚、甘草查爾酮A等。槲皮素對卵清蛋白誘導(dǎo)的過敏性鼻炎有緩解效果[6]；槲皮素和山柰酚治療過敏性鼻炎的作用機(jī)制與HMOX-1[7-8]和抑制IgE介導(dǎo)的TNF-α和IL-6的產(chǎn)生相關(guān)[9]；甘草查爾酮A能抑制單核細(xì)胞和T細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)作用[10]。這些研究報(bào)道與本研究結(jié)果一致，提示黃酮類成分是桂枝顆粒治療鼻炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。

萜類成分包括芍藥苷、蒼耳酮、樺木酸和β-胡蘿卜素，生物堿包括小檗堿和荷葉堿，植物甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇和川貝海綿甾醇。目前雖尚無文獻(xiàn)報(bào)道這些成分與鼻炎之間的直接聯(lián)系。但這4類化合物都具有調(diào)節(jié)免疫，抑制炎癥反應(yīng)的作用[11-14]。結(jié)合本研究結(jié)果可推測桂枝顆粒中的黃酮類、萜類、香豆素、生物堿、植物甾醇等成分可能是其發(fā)揮治療鼻炎療效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 桂枝顆粒治療鼻炎的關(guān)鍵通路 桂枝顆粒通過多成分-多靶點(diǎn)-多通路發(fā)揮治療鼻炎的藥效。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，桂枝顆粒治療鼻炎的作用機(jī)制涉及TNF、FoxO、Fc epsilon RI、T細(xì)胞受體、IL-17、MAPK、Th17、Relaxin和HIF-1等信號通路。

TNF信號通路可觸發(fā)NF-κB和MAPK途徑。TNF是一種可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，對正常細(xì)胞沒有明顯細(xì)胞毒性的細(xì)胞因子。其參與全身炎癥反應(yīng)，是組成急性期反應(yīng)的細(xì)胞因子之一。王忠喜[15]研究表明在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病中TNF-α和IL-8發(fā)揮了重要的作用。Fc epsilon RI復(fù)合物是由抗原特異性IgE的Fc端與細(xì)胞表面高親和力受體相互作用而形成，過敏性鼻炎中Fc epsilon RI復(fù)合物水平增加，可進(jìn)一步誘導(dǎo)B細(xì)胞中的IgE合成，加重鼻炎[16]。桂枝顆?？赡芡ㄟ^降低Fc epsilon RI復(fù)合物水平達(dá)到緩解鼻炎的作用。T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體可特異性識別抗原提呈細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體提呈的抗原肽，并激活T細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、NF-κB等信號通路，從而調(diào)控T細(xì)胞的增殖、分化、死亡。Th17細(xì)胞是由Th0細(xì)胞在IL-6和轉(zhuǎn)化生長因子β的刺激下分化而成的，在免疫調(diào)節(jié)、宿主防御和自身免疫性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。石小偉等[17]研究表明間歇性變應(yīng)性鼻炎患者外周血中Th17細(xì)胞占外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞的比例在間歇期降低，發(fā)作期前、發(fā)作期升高，表明Th17細(xì)胞表達(dá)與過敏性鼻炎發(fā)病有關(guān)。Cheng等[18]研究表明過敏組中產(chǎn)生IL-17α的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加，同時(shí)過敏組中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)Th17產(chǎn)生的能力顯著降低。IL-17在宿主免疫學(xué)中起關(guān)鍵作用，其可以保護(hù)宿主抵抗細(xì)胞外病原體，但也可以激活MAPK、NF-κB等途徑中的抗細(xì)胞因子和趨化因子，促進(jìn)自身免疫性疾病的炎癥病理。 Lv等[19]觀察到百里香可降低IL-17基因表達(dá)，減輕過敏性鼻炎癥狀。MAPK信號通路是真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信號到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡和死亡等多種生理過程。Liu等[20]研究認(rèn)為p38 MAPK信號通路調(diào)控Th2細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致過敏性鼻炎的發(fā)病。既往研究[21]顯示HIF-1α可緩解過敏性鼻炎模型小鼠的鼻炎癥狀。

4 結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，揭示了桂枝顆粒中黃酮類等成分調(diào)控免疫相關(guān)通路治療鼻炎的作用機(jī)制，可為闡明該制劑治療鼻炎的作用機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)，但這些成分與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。