丁茂鵬， 韋凌霞， 王志旺， 姚 楠， 龐亞蓉

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是指由多種致病因素所致肝內(nèi)纖維組織異常增生的病理過程，其持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致肝硬化[1]，最好的治療方法是阻止或逆轉(zhuǎn)其纖維化過程。目前抗肝纖維化的西藥療效尚不明確，而中醫(yī)藥在治療慢性復(fù)雜性疾病方面有明顯優(yōu)勢[2]。源于《金匱要略》的鱉甲煎丸具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、補(bǔ)益虛損、祛痰除濕之效，是傳統(tǒng)中醫(yī)治療瘧母的專方，現(xiàn)代多用于治療肝纖維化，臨床上取得了顯著療效[3]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的角度探討鱉甲煎丸治療肝纖維化的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鱉甲煎丸關(guān)鍵成分的篩選 以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.36、藥物半衰期(HL)≥4為條件，在TCMSP數(shù)據(jù)庫對鱉甲煎丸中16味藥材的成分進(jìn)行篩選，同時(shí)查閱文獻(xiàn)，對具有抗肝纖維化的成分進(jìn)行了補(bǔ)充。對于6味動物藥、1味礦物藥，在CNKI、萬方數(shù)據(jù)庫中篩選近十年標(biāo)注有“抗炎”“抗肝纖維化”作用的相關(guān)成分。

1.2 鱉甲煎丸靶點(diǎn)的查詢與成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過TCMSP、CTD、UniProt數(shù)據(jù)庫，查詢篩選所得成分的作用靶點(diǎn)及其基因，將其導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，化合物及其靶點(diǎn)由節(jié)點(diǎn)表示，2個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系由邊線表示，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要性通過拓?fù)鋮?shù)度數(shù)進(jìn)行評判，度數(shù)越大，該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要[4]，篩選出度數(shù)靠前者作為核心成分。

1.3 肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)的篩選與疾病-中藥-成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在GeneCards、CoolGene數(shù)據(jù)庫中輸入“hepatic fibrosis”檢索肝纖維化的相關(guān)靶點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)度分析。將鱉甲煎丸成分、肝纖維化的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配映射，獲得關(guān)鍵成分治療肝纖維化關(guān)鍵靶點(diǎn)。將疾病、中藥、關(guān)鍵成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建疾病-中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO富集分析、KEGG通路分析 利用DAVID平臺對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(GO)分析、KEGG通路分析，從生物過程、分子功能、細(xì)胞組成3個(gè)模塊進(jìn)行GO富集分析，采用OriginPro軟件將富集結(jié)果靠前的條目繪制成條形圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 在STRING數(shù)據(jù)庫輸入關(guān)鍵靶點(diǎn)，限定物種為人，得到蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，借助Cytoscape軟件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)，并篩選度數(shù)靠前的靶點(diǎn)作為后續(xù)分析的核心靶點(diǎn)。

1.6 分子對接分析 在Pubchem數(shù)據(jù)庫中詢查核心成分的3D結(jié)構(gòu)，將它與核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Systems DockWeb Site中進(jìn)行分子對接，獲得對接驗(yàn)證及其對接打分值(Docking score)，大于4.25表明具有一定的結(jié)合活性，大于5.0表明分子與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，大于7.0表明分子與靶點(diǎn)的結(jié)合模型具有強(qiáng)烈的穩(wěn)定性及活性[5]。

2 結(jié)果

2.1 鱉甲煎丸關(guān)鍵成分的篩選 在TCMSP、CNKI數(shù)據(jù)庫中，篩選出鱉甲煎丸植物藥中抗纖維化活性較高的70種成分，另外動物藥、礦物藥共有35種，去掉重復(fù)項(xiàng)后得到78種關(guān)鍵成分，見表1～2。

表1 鱉甲煎丸植物藥中關(guān)鍵成分

表2 鱉甲煎丸動物藥、礦物藥中關(guān)鍵成分

2.2 鱉甲煎丸靶點(diǎn)預(yù)測 將鱉甲煎丸關(guān)鍵成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫得到對應(yīng)的靶點(diǎn)，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫矯正為標(biāo)準(zhǔn)名稱，共得到1 777個(gè)靶點(diǎn)；部分動物藥、礦物藥的化學(xué)成分在CTD數(shù)據(jù)庫中查詢，共得到276個(gè)靶點(diǎn)。將在TCMSP與CTD中檢索到的靶點(diǎn)合并，去除重復(fù)項(xiàng)后得到478個(gè)靶點(diǎn)。將“2.1”項(xiàng)下78種關(guān)鍵成分與478個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件來構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1，紅色為靶點(diǎn)，藍(lán)色為鱉甲煎丸成分，可知共有555個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 050條邊，度數(shù)靠前的成分是鱉甲煎丸治療肝纖維化關(guān)鍵成分，取前9種進(jìn)行后續(xù)研究，見表3。

表3 鱉甲煎丸核心成分

圖1 鱉甲煎丸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 肝纖維化靶點(diǎn)的預(yù)測 通過GeneCards、CoolGene數(shù)據(jù)庫，預(yù)測出肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)分別為3 926、1 011個(gè)，將其與“2.2”項(xiàng)下478個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到80個(gè)共有靶點(diǎn)，即為鱉甲煎丸抗肝纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。將肝纖維化、中藥、成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建疾病-中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 鱉甲煎丸疾病-中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集分析、KEGG信號通路分析 將“2.3”項(xiàng)下80個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入DAVID網(wǎng)站，進(jìn)行GO富集分析與KEGG信號通路分析。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，與鱉甲煎丸抗肝纖維化相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及167條生物過程、28種分子功能、20個(gè)細(xì)胞組分；KEGG通路分析顯示，這些關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及到107條信號通路，其中前10條過程和通路見圖3。

圖3 鱉甲煎丸GO富集分析、KEGG信號通路分析(前10條)

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“2.3”項(xiàng)下80個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING網(wǎng)站進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，同時(shí)借助Cytoscape軟件篩選核心靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，PPI網(wǎng)絡(luò)共涉及79個(gè)節(jié)點(diǎn)，333條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為8.43，取前10個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究，見圖4、表4。

表4 鱉甲煎丸抗肝纖維化的核心靶點(diǎn)(前10個(gè))

圖4 鱉甲煎丸PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接分析 表5顯示，對接分?jǐn)?shù)4.25～5.0的有7個(gè)，5.0～7.0的有25個(gè)，大于7.0的有4個(gè)；鱉甲煎丸成分、靶點(diǎn)基因的對接分?jǐn)?shù)均大于4.25，大部分集中于5.0～7.0之間。

表5 鱉甲煎丸核心成分與核心靶點(diǎn)的分子對接

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，依托化學(xué)成分、靶點(diǎn)及其生物信息等多個(gè)數(shù)據(jù)庫，富集鱉甲煎丸治療肝纖維化的成分、靶點(diǎn)及其相關(guān)信號通路，探討鱉甲煎丸治療肝纖維化的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚等9種化學(xué)成分匹配到較多的肝纖維化靶點(diǎn)，是鱉甲煎丸治療肝纖維化的核心成分，這與目前的相關(guān)研究結(jié)果一致。β-谷甾醇具有抗氧化，抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，可誘導(dǎo)人肝癌HepG2/ SMMC-7721細(xì)胞凋亡，抑制脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷[6-7]。槲皮素抑制肝星狀細(xì)胞活化緩解肝纖維化，通過抑制TGF-β1/Smads信號通路并激活PI3K/Akt信號通路來緩解膽管結(jié)扎或CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化自噬作用[8]。山柰酚通過下調(diào)IL-13和COL1基因表達(dá)，抑制膠原蛋白合成，同時(shí)上調(diào)MMP-2基因表達(dá)而促進(jìn)膠原分解，發(fā)揮治療血吸蟲肝纖維化的作用[9]。

在作用機(jī)制分析過程中，發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF及MAPK等10個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮核心作用，它們主要涉及肝炎、肝纖維化及肝硬化等病理過程。IL-6是與肝纖維化關(guān)系最密切的細(xì)胞因子，能激活STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]。IL-6通過mTOR/STAT3信號途徑，刺激CD4+T淋巴細(xì)胞胞內(nèi)蛋白STAT3磷酸化及表達(dá)增加，STAT3磷酸化后形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Th17細(xì)胞增殖、分化，加速Th17細(xì)胞表達(dá)IL-17，造成肝衰竭[11]。TNF-α主要由淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞分泌，能夠刺激內(nèi)毒素誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-6、IL-8等的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)肝細(xì)胞炎性反應(yīng)，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[12]。MAPK1是MAPK信號通路的重要信號通路蛋白，主要參與細(xì)胞增殖、生長及分化等過程的調(diào)控，在癌癥的發(fā)展過程中具有促進(jìn)作用[13]。上述因子之間又存在著密切的關(guān)系，如JAK/STAT3通路與MAPK通路協(xié)同調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)TNF-α的轉(zhuǎn)錄活性[14]。EGFR和TP53與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系十分緊密，EGFR是原癌基因c-erbB-1(HER-1)的表達(dá)產(chǎn)物，參與肝組織再生過程[15]，而TP53在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[16]。通路富集的結(jié)果顯示，鱉甲煎丸關(guān)鍵成分作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)分布于不同的信號通路，可通過多通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗肝纖維化作用。此外，本研究采用了分子對接技術(shù)，探討了核心成分與核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合能力，為鱉甲煎丸所含核心成分治療肝纖維化提供了理論依據(jù)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對鱉甲煎丸治療肝纖維化多成分-多靶點(diǎn)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)分析，結(jié)果提示鱉甲煎丸通過多種成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗肝纖維化的綜合作用。