付小梅， 王 芳， 劉 婧， 黃 瀟， 楊 超， 高 莎， 劉德鴻， 吳志瑰， 裴建國(guó)

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004)

肝內(nèi)膽汁淤積是由于肝細(xì)胞或膽管的膽汁合成、轉(zhuǎn)運(yùn)或流動(dòng)障礙，使膽汁無(wú)法順利流入十二指腸，從而導(dǎo)致膽汁酸在肝臟內(nèi)蓄積，最終引發(fā)肝臟病變的臨床綜合征[1]。熊去氧膽酸、S-腺苷蛋氨酸、糖皮質(zhì)激素等是目前臨床上常選用的治療該疾病的主要藥物，然而這些藥物均存在療效慢、價(jià)格貴、長(zhǎng)期服用后出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)等弊端，因此研究毒副作用小、起效快的抗肝內(nèi)膽汁淤積的化學(xué)及天然藥物迫在眉睫。

梔子來(lái)源于茜草科梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)，在江西稱為“小紅梔”，是江西著名的道地藥材“三子一殼”之一，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的功效，長(zhǎng)久以來(lái)用于中醫(yī)臨床的保肝利膽藥。前期藥理研究表明梔子具有良好的利膽保肝效果，同時(shí)含有梔子的復(fù)方對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷也具有良好的防治作用[2-5]，然而有關(guān)其治療肝內(nèi)膽汁淤積物質(zhì)卻未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采用α-萘異硫氰酸酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT) 誘導(dǎo)急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠，對(duì)梔子醇提物不同洗脫部位進(jìn)行了藥效學(xué)研究，篩選出梔子抗肝內(nèi)膽汁淤積有效部位，并應(yīng)用UPLC-LTQ-Orbitrap技術(shù)對(duì)各有效部位的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了鑒定分析，明確主要的活性成分，為梔子對(duì)SD大鼠肝內(nèi)膽汁淤積的作用機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 LTQ-Oribitrap XL線性離子阱-串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；Agilent 1260 型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Sicentific公司)；VCX150超聲破碎儀(美國(guó)Sonics & Materials公司)；JW-3021 HR型高速冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；Forma -86C ULT超低溫冰箱(美國(guó)Thermo electron 公司)；HYD-205型-20 ℃低溫冰箱(海爾集團(tuán)公司)；Y2D-Ⅱ型水平搖床(江蘇天翎儀器有限公司)。

1.2 藥材與試劑 梔子收集于江西省新干縣梔子GAP基地，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付小梅教授鑒定為梔子GardeniajasminoidesEllis的果實(shí)，標(biāo)本存于江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室，按2020年版《中國(guó)藥典》方法進(jìn)行干燥，備用。京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷、京尼平苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ對(duì)照品均為自制，純度均大于98%。熊去氧膽酸片(上海信宜藥廠有限公司，批號(hào)41140501)。α-萘異硫氰酸酯(中國(guó)阿拉丁試劑公司，批號(hào)K1424065)；總膽汁酸(TBA，批號(hào)20170214)、總膽紅素(TBIL，批號(hào)20170115)、直接膽紅素(DBIL，批號(hào)20170323)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，批號(hào)20170323)均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。甲醇、乙腈(西隴化工有限公司，色譜純)。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，雄性，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)SCXK2019-0004。飼養(yǎng)環(huán)境溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，自由飲食。

2 方法和結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 梔子有效部位的制備 稱取藥材1.5 kg，粉碎，過(guò)2號(hào)篩，置20 L圓底燒瓶中，加入70%乙醇15 L回流2 h，抽濾，再加入70%乙醇12 L回流2 h，抽濾，合并兩次濾液，40 ℃減壓回收乙醇后冷凍干燥，得梔子總提取物干浸膏共359.14 g。取250 g梔子總提取物干浸膏，加1 L水制成混懸液，上HPD-600型大孔樹脂，依次用8倍量水、8倍量30%乙醇、8倍量70%乙醇、8倍量95%乙醇洗脫，得到4個(gè)洗脫部位，分別減壓濃縮后冷凍干燥，分別得水部位77.73 g、30%乙醇洗脫部位71.22 g、70%乙醇洗脫部位48.21 g、95%乙醇洗脫部位17.75 g，備用。

2.1.2 梔子4個(gè)有效部位中5種主要成分含量測(cè)定

2.1.2.1 供試品溶液制備 分別取上述4個(gè)洗脫部位粉末約50 mg，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇制成0.5 mg/mL樣品溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.1.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品(京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷、京尼平苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ)適量，加甲醇制成對(duì)照品溶液。

2.1.2.3 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)；梯度洗脫(0～10 min，6%A；10～18 min，6%～12%A；18～22 min，12%～16%A；22～28 min，16%～20%A；28～40 min，20%A；40～60 min，20%～36%A；60～65 min，36%～55%A)；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230、440 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2.4 線性關(guān)系考察 將對(duì)照品按不同比例稀釋，在“2.1.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 5種成分線性關(guān)系

2.1.2.5 方法學(xué)考察 分別取上述對(duì)照品溶液或供試品溶液，進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RSD均<3.0%，符合HPLC分析要求。色譜圖見圖1，含量測(cè)定結(jié)果見表2。

1.京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷 2.京尼平苷 3.西紅花苷-Ⅰ 4.西紅花苷-Ⅱ 5.西紅花苷-Ⅲ

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果

2.2 有效部位篩選

2.2.1 造模及給藥 將56只SD大鼠隨機(jī)分為空白組組(0.5%CMC-Na溶液)、模型組(0.5%CMC-Na溶液)、陽(yáng)性藥組(100 mg/kg熊去氧膽酸)、水洗脫部位組(4 g生藥/kg)、30%乙醇洗脫部位組(4 g生藥/kg)、70%乙醇洗脫部位組(6 g生藥/kg)、95%乙醇洗脫部位組(4 g生藥/kg)，每組8只。陽(yáng)性藥組及各洗脫部位組均用0.5%CMC-Na溶液溶解，ANIT用橄欖油溶解。各組均連續(xù)灌胃給藥7 d，在第5天給藥后2 h，空白組灌胃給予65 mg/kg橄欖油，其他各組均一次性灌胃給予65 mg/kg ANIT進(jìn)行造模，結(jié)束后繼續(xù)給藥。

表3顯示，與空白組比較，模型組大鼠在0～120 min內(nèi)各時(shí)間段的膽汁流量均降低(P<0.01)；與模型組比較，不同洗脫部位均能在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同程度增加膽汁量(P<0.05，P<0.01)，其中30%乙醇洗脫部位組程度最大，表明該部位可顯著恢復(fù)ANIT誘發(fā)的肝內(nèi)膽汁淤積大鼠的膽汁流量。

表3 梔子不同洗脫部位對(duì)ANIT致膽汁淤積大鼠膽汁流量的影響[μL·(min·100 g)-1]

2.2.3 血清中TBIL、DBIL、TBA、ALT測(cè)定 膽汁收集完成后，腹主動(dòng)脈取血，全血4 ℃離心5 000 r/min離心10 min，置于4 ℃冰箱中備用。取血后處死大鼠，快速取肝臟，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈后10%甲醛溶液固定，備用。根據(jù)TBIL、DBIL、TBA和ALT檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，測(cè)定血清中各指標(biāo)水平，結(jié)果見表4。與空白組比較，模型組血清中DBIL、TBIL、TBA水平升高，表明經(jīng)過(guò)ANIT誘導(dǎo)之后，大鼠發(fā)生急性膽汁淤積，膽汁酸不能外排，只能返回入血，同時(shí)引起肝內(nèi)敏感性ALT的活性增加(P<0.01)，表明大鼠的肝功能出現(xiàn)了異常。與模型組比較，梔子30%乙醇洗脫部位組的TBIL及ALT水平降低(P<0.01)，DBIL與TBA水平降低(P<0.05)；梔子70%與95%乙醇洗脫部位組的TBIL與TBA水平降低(P<0.05)，表明梔子30%乙醇洗脫部位組的作用最優(yōu)。

表4 梔子不同洗脫部位對(duì)ANIT致膽汁淤積大鼠血清DBIL、TBIL、TBA、ALT水平的影響

2.2.4 肝組織病理學(xué)檢測(cè) 將已固定的大鼠肝臟取出，經(jīng)乙醇脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、粘片、HE染色后，用顯微鏡觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化，見圖2?？瞻捉M大鼠肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)炎癥細(xì)胞滲出，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，染色體質(zhì)豐富，肝細(xì)胞排列成條索狀，肝血竇清晰；模型組肝細(xì)胞腫大，有的可見明顯點(diǎn)狀或灶性壞死，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝血竇擴(kuò)張，可見紅細(xì)胞；與模型組比較，30%乙醇洗脫部位組小葉結(jié)構(gòu)均較清楚，肝細(xì)胞排列較整齊，肝血竇稍擴(kuò)張，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，表明該部位顯著改善ANIT導(dǎo)致的病理?yè)p傷。根據(jù)上述結(jié)果可知，對(duì)于改善肝內(nèi)膽汁淤積而言，梔子30%乙醇洗脫部位藥效最好。

注：A為空白組，B為模型組，C為陽(yáng)性藥組，D為梔子水部位組，E為梔子30%乙醇部位組，F(xiàn)為梔子70%組乙醇部位組，G為梔子95%乙醇部位組。

2.3 UPLC-LTQ-Orbitrap分析鑒定梔子30%乙醇洗脫部位化學(xué)成分

2.3.1 供試品溶液制備 取梔子30%乙醇洗脫部位粉末約10 mg，置具塞錐形瓶中，加10 mL甲醇超聲溶解，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3.2 分析條件 YMC-UltraHT Pro C18色譜柱(2.0 mm×100 mm，2 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，5%～15%B；10～12 min，15～20%B；12～20 min，20%～50%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子掃描；離子源溫度300 ℃；鞘氣體積流量35 psi(1 psi=6.89 kPa)；輔助氣10 psi；噴霧電壓3.60 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；掃描范圍m/z300～1 000。

2.3.3 化學(xué)成分分析 運(yùn)用MassLynx V4.1對(duì)正負(fù)兩種離子模式下總離子流圖進(jìn)行分析處理，將各色譜峰的紫外吸收光譜圖，一級(jí)質(zhì)譜提供的相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜提供的離子信息與對(duì)照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比較，對(duì)梔子30%乙醇洗脫部位化學(xué)成分進(jìn)行識(shí)別鑒定，共鑒定出了12個(gè)化合物，11個(gè)為環(huán)烯醚萜苷類[6-7]，結(jié)果見圖3、表5。

10. 京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷 11. 京尼平苷

表5 梔子30%乙醇洗脫部位化學(xué)成分

3 討論

肝內(nèi)膽汁淤積癥是內(nèi)科臨床上的常見綜合癥，目前治療方式主要是以膽道疏通、膽汁引流和藥物治療為主。ANIT是誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物肝損傷建立肝內(nèi)膽汁淤積動(dòng)物模型的常用藥物[8-9]，本實(shí)驗(yàn)采用了ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積模型進(jìn)行梔子抗肝內(nèi)膽汁淤積有效部位的篩選及藥效評(píng)價(jià)。

ANIT導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積的主要機(jī)制是與肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，致使肝細(xì)胞變性、壞死，可能導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞腫脹、壞死，引起炎癥及膽管阻塞，形成肝內(nèi)膽汁淤積，其誘發(fā)的肝損傷呈現(xiàn)的生化指標(biāo)和病理改變與人體相似[10]。當(dāng)肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)生后，膽道排泄系統(tǒng)受到極大影響，依賴該系統(tǒng)進(jìn)行的膽汁和肝功能酶的正常排泄受阻，肝內(nèi)膽紅素和膽汁酸濃度將急劇升高，逆流入血液；另外，肝細(xì)胞及膽管的炎癥，肝細(xì)胞變性壞死或細(xì)胞膜通透性增加，使肝功能酶ALT將滲入血液中，導(dǎo)致膽汁淤積后血清中ALT水平增加，故常通過(guò)檢測(cè)血清內(nèi)膽汁酸、總膽紅素及肝功能酶的活性來(lái)初步預(yù)測(cè)肝內(nèi)膽汁淤積治療情況[11-14]。本研究表明梔子30%乙醇洗脫部位改善肝內(nèi)膽汁淤積的作用最為顯著，該部位不僅可以恢復(fù)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠的膽汁流量，降低血清中TBIL、DBIL、TBA、ALT的水平；肝組織病理形態(tài)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該部位在一定程度上減少膽汁淤積所致的肝細(xì)胞變性壞死，降低肝損傷程度，對(duì)ANIT導(dǎo)致肝損傷具有緩解作用，因此該部位為梔子抗肝內(nèi)膽汁淤積有效部位。

為了進(jìn)一步確定梔子30%乙醇洗脫部位的化學(xué)成分，明確梔子治療肝內(nèi)膽汁淤積的物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-LTQ-Orbitrap技術(shù)對(duì)該部分進(jìn)行了分析鑒定，共鑒定出12個(gè)化合物，其中化合物4京尼平苷酸和化合物7京尼平苷均已被證明具有治療肝內(nèi)膽汁淤積癥的作用[11，15-16]，而該部位中其它單體成分是否具有治療作用，成分與成分之間是否有相互作用將進(jìn)一步深入研究。