夏道韞，許琳楓，柴彬淑，郭 靜，孫強玲，李艷利

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]。最新的癌癥數(shù)據(jù)分析顯示，肺癌的發(fā)病率在男性中僅次于前列腺癌，在女性中僅次于乳腺癌[2]。肺癌可以分為兩種，分別是小細胞肺癌（small cell lung can-cer，SCLC）和非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC），NSCLC 約占肺癌總數(shù) 85%[3]。而NSCLC 又可以分為肺腺癌、肺鱗癌和大細胞癌[4]。NSCLC的早期癥狀不明顯，目前的診斷手段也不成熟，導致大多數(shù)患者確診時已是晚期。此外，NSCLC的復發(fā)率較高，患者5 年生存率低于15%[2]。因此，對NSCLC診斷以及治療靶點的研究迫在眉睫。

長鏈非編碼 RNA（long non?coding RNA，lncRNA）是一種轉錄本長度超過200個核苷酸非編碼RNA，。lncRNA具有多種生物學功能，如基因表達、表觀遺傳以及染色體裝配等[5-7]。隨著對lncRNA 在細胞生物學中功能的深入研究，大量臨床觀察和實驗結果顯示，許多l(xiāng)ncRNA表現(xiàn)出在特異性細胞及組織中存在差異表達，這些表達及功能異常的lncRNA可以通過多種途徑調節(jié)DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和作為miRNA的前體，從而導致多種疾病的發(fā)生，并且主要體現(xiàn)在多種腫瘤疾病上，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[8-10]。通過生物信息學分析顯示，發(fā)現(xiàn)了14個差異表達的lncRNAs，其中LINC01296 差異表達較為顯著[11]。因此，本研究旨在分析LINC01296 在體內(nèi)和體外對NSCLC 的作用及與miR?1255b?5p的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 患者樣本 選取上海交通大學附屬上海胸科醫(yī)院的肺癌患者樣本，樣本采集于2018 年，樣本數(shù)為40 例，凍存于?80 ℃保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)院倫理委員會審核批準，所有患者均對本次研究知情并簽署知情同意書（倫理號：IS2112）。

1.1.2 細胞系 本研究所用到的細胞系包括6 種NSCLC 細胞系（H1299、A549、PC?9、HCC827、H1975和95?D），人胚腎細胞系（HEK?293T）和人肺上皮細胞系（BEAS?2B）。其中H1299 購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，其他的細胞系購自中國科學院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 NSCLC細胞培養(yǎng) 按照ATCC提供的細胞培養(yǎng)的標準：A549、PC?9、HEK?293T 和 BEAS?2B 細胞使用DMEM 培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）進行培養(yǎng)；而H1299、HCC827、H1975 和 95?D 細胞則使用 RPMI培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），并在培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（Gibco 公司，美國）。細胞放置在環(huán)境為37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2 qRT?PCR 檢測 LINC01296 的表達 本實驗使用Trizol 試劑，并參照試劑說明書的標準方法提取NSCLC細胞以及患者樣本RNA，并使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 的試劑盒（TaKaRa公司，日本）進行l(wèi)ncRNA逆轉錄合成cDNA。取2μL cDNA作為模板，SYBR?PrimeScriptTMⅡ試劑盒產(chǎn)品進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real time?polymerase chain reaction，qRT ? PCR）檢 測LINC01296 的表達水平，共 10 μL qRT?PCR 反應體系，反應程序為95 ℃、10 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，擴增40個循環(huán)，采用2?ΔΔCT相對定量法進行分析與比較。

1.2.3 shRNA 載體構建 首先在網(wǎng)站上設計shRNA 序列，每一對包含正義和反義寡核苷酸鏈互補序列。配制shRNA反應體系，以獲得退火產(chǎn)物。之后利用T4 DNA 連接酶催化退火產(chǎn)物連接到pLKO.1 載體（實驗室儲存質粒）上，4 ℃過夜連接。取2 μL 連接產(chǎn)物和25 μL DH5α 進行轉化，以獲得大量目的質粒。

1.2.4 穩(wěn)轉細胞株的構建 本實驗所用的穩(wěn)轉細胞株包括穩(wěn)定敲低LINC01296 基因的細胞株。培養(yǎng)293T 細胞并使其保持良好的生長狀態(tài)，采用psPAX2 和pMD2G 共轉染的方法獲得病毒溶液。在轉染的24、48、72 h 后分別收集細胞培養(yǎng)基即病毒液，收集的病毒液放在4 ℃離心機中4 000 r 離心10 min。用0.45 μm濾器過濾得到病毒液。將病毒液與培養(yǎng)基等比例混合，加入到密度為70%左右的細胞中進行感染，同時加入10 μg 聚凝胺（polybrene）促進感染。最后通過加藥篩選或流式細胞分選得到成功穩(wěn)轉的細胞。

1.2.5 細胞表型實驗

1.2.5.1 CCK?8比色法檢測細胞增殖 取NSCLC 細胞，在96 孔細胞培養(yǎng)板中每孔接種1 500 個細胞，設置4 個復孔，在細胞周圍的孔中加入適量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)以防培養(yǎng)基蒸發(fā)。在37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后細胞貼壁，此時每孔加入100 μL 的5%細胞計數(shù)試劑盒?8（cell counting kit?8，CCK?8）試劑（由無血清培養(yǎng)基配制），孵育 2 h 后吸取 95 μL 液體放入 96 孔酶標板中，在450 nm 波長處測OD 值，由于此時細胞尚未分裂，此時細胞密度可作為原始密度。此后繼續(xù)檢測 24、48、72、96 h時的 OD 值。

1.2.5.2 細胞克隆形成實驗 取NSCLC細胞，6孔板中每孔鋪板300~600個細胞，在37 ℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后，細胞形成菌落。加入200μL無水甲醇固定細胞15 min。吸去無水甲醇，加入200μL草酸銨結晶紫溶液，靜置染色15 min。吸除染液，用蒸餾水洗滌至無紫色為止，之后拍照計數(shù)，處理數(shù)據(jù)。

1.2.5.3 劃痕試驗 取NSCLC 細胞，鋪30%~40%密度的細胞于12 孔板中，每個樣品2 個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞長滿培養(yǎng)板底部時便可實施劃痕實驗。劃痕之后，用PBS清洗細胞，確保懸浮的細胞被沖洗干凈。用封口膜包裹好培養(yǎng)板，拍照（0 h位置），24 h 后第2次拍照。對比兩次拍照的劃痕大小處理數(shù)據(jù)，按公式細胞遷移率=（0 h 時劃痕寬度-24 h時劃痕寬度）/0 h 時劃痕寬度進行計算。

1.2.5.4 FITC?Annexin?V 試劑盒檢測細胞凋亡 取NSCLC細胞，12孔板中鋪細胞培養(yǎng)，密度達到80%~90%時，用超凈臺紫外光照誘導處理細胞2 h。用無EDTA的胰酶消化收集細胞，每個樣品加入50μL結合緩沖液（Binding Buffer），分配好空白和單染對照（用以調整熒光補償），剩余的全部加入2.5μL Annexin V?FITC 和 2.5 μL PI，室溫避光孵育 15 min 以上，200目濾膜過濾后，將樣品裝入流式細胞儀檢測凋亡細胞的百分率。

1.3 動物實驗 裸鼠10 只（BALB/c?Nude裸鼠，6 周齡雌性）購自上海斯萊克實驗動物有限公司。在特定的無病原環(huán)境中飼養(yǎng)7 d后，隨機分為兩組，每組5 只，分別為對照組和實驗組。在對照組中，每只小鼠右腹部皮下和小鼠尾部靜脈注射A549?pLKO.1（低表達 LINC01296 的A549）細胞個數(shù)分別為5×106個，2.5×106個。實驗組小鼠用同樣的方式注射 A549?shLINC01296?2 細胞。使用游標卡尺每周測量一次皮下腫瘤的長和寬，計算瘤體的大小，8 周后處死小鼠。計算皮下腫瘤體積、重量以及肺結節(jié)數(shù)。動物實驗遵循上海大學動物保護和使用委員會的規(guī)定。

1.4 雙熒光素酶報告基因實驗 本實驗采用pRL和pGL3 兩種質粒。將含有miR?1255b?5p結合位點的LINC01296 序列 插入 pGL3 載 體(pGL3 ?LINC01296 WT)的Xba I/EcoR I位點，構建pGL3?LINC01296 WT報告載體。另外構建突變體LINC01296 (pGL3?LINC01296 Mut)。將pGL3?LINC01296 WT或pGL3?LINC01296 Mut 報告載體、海腎螢光素酶報告載體(pRL)和miR?1255b?5p模擬物共轉染到293T細胞中。使用Invitrogen 的Lipofectamine 2 000進行細胞轉染。48 h 后用 Promega 公司的 Dual?Luciferase Reporter Assay System 進行雙熒光檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用GraphPad Prism 5.0軟件，完成數(shù)據(jù)分析和繪制統(tǒng)計圖表，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用雙t檢驗，為了保證實驗數(shù)據(jù)的真實和準確，每個實驗均有3 次獨立的生物學重復，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LINC01296 在NSCLC 中的表達 本研究首先通過在線數(shù)據(jù)庫（http://gepia2.cancer-pku.cn/#degenes）分析LINC01296的表達水平，發(fā)現(xiàn)相比于正常組織，LINC01296在NSCLC中的表達顯著上調（上調約為 5 倍）。進一步通過 qRT?PCR 檢測LINC01296 在 6 種 NSCLC 細胞系（H1299、A549、HCC827、H1975、PC?9 和95?D）和正常人肺上皮細胞BEAS?2B 中的表達水平（圖 1a）。與 BEAS?2B 相比，LINC01296 在 6 種 NSCLC 細胞系中的表達水平均是上調的。 為了進一步驗證實驗結論，選取了患者樣本，對樣本中的LINC01296的表達水平進行檢測(圖1b)。結果顯示，與正常組織相比，LINC01296在癌癥組織中顯著高表達。

圖1 LINC01296在癌細胞以及腫瘤組織中表達

2.2 敲低LINC01296對NSCLC細胞生長、遷移的影響 用CCK?8法和克隆形成實驗研究LINC01296基因敲低對NSCLC 細胞系體外增殖的影響。結果表明，與對照組細胞A549?pLKO.1和H1299?pLKO.1比較，A549?shLINC01296?2 和 H1299?shLINC01296?2的細胞增殖和克隆形成能力均受到顯著抑制（圖2）。

圖2 敲低LINC01296基因對抑制NSCLC細胞生長的影響a~b：CCK?8 法檢測敲低 LINC01296 基因，與未敲低相比，H1299 和A549 細胞增殖受到抑制；c~d：克隆形成實驗敲低LINC01296基因，與未敲低相比，H1299和A549細胞增殖能力顯著下降，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

進一步采用劃痕實驗研究兩種NSCLC 穩(wěn)轉細胞系的遷移能力。與對照組細胞A549?pLKO.1 和H1299?pLKO.1 比較 LINC01296 敲低的穩(wěn)轉細胞A549?shLINC01296?2 和 H1299 ?shLINC01296?2 的遷移能力顯著降低（圖3）。

圖3 敲低LINC01296基因對NSCLC細胞遷移的影響

2.3 敲低LINC01296 對體內(nèi)瘤體生長和轉移的影響 以上的體外實驗均證明LINC01296影響NSCLC的發(fā)生發(fā)展。為證明本研究的結論，進行了動物實驗。為符合動物保護倫理，將其中2 只裸鼠安樂死，對其余3 只進行分析處理。每周測量皮下腫瘤大?。▓D4a），并計算最終皮下腫瘤的重量（圖4c），圖b 是8 周后小鼠瘤體圖像。與對照組相比，實驗組的腫瘤大小和重量增加得更慢（圖4a、c）

圖4 LINC01296水平的減少對體內(nèi)腫瘤生長和轉移的影響

2.4 LINC01296 通過 miR?1255b?5p 海綿吸附作用對肺癌的影響 為了進一步研究LINC01296 對NSCLC 調控的分子機制，首先通過StarBase(starbase.sysu.edu.cn/)、TargetScan (targetscan.org/vert72)以及miRanda (microrna. org) 預測網(wǎng)站預測LINC01296 靶向結合的microRNA，然后取交集，最終 篩 選 出 miR?1255b?5p。 miR?1255b?5p 與LINC01296 上的靶序列互補配對的模式圖（圖5a）。實驗結果表明，miR?1255b?5p 直接靶向LINC01296的種子序列對LINC01296 發(fā)揮抑制作用。為了驗證 LINC01296 直 接 靶 向 miR?1255b?5p，先 將LINC01296野生型(LINC01296?WT)的結合位點連接到攜帶pGL3載體的熒光素酶開放閱讀框的下游，形成pGL3?LINC01296 ? WT。 pGL3?LINC01296 ? WT 和miR?1255b?5p mimic共轉染后，與對照組相比，293T細胞中的熒光素酶活性顯著降低，而在突變體組中觀察到相反的結果(圖 5a)。此外，qRT?PCR 結果顯示，LINC01296敲除的穩(wěn)定細胞中miR?1255b?5p 的表達顯著上調(圖 5b?c)。綜上，說明 LINC01296 能起miR?1255b?5p海綿作用。

圖5 LINC01296吸附miR?1255b?5p對其表達的影響

2.5 LINC01296 與 miR?1255b?5p 的表達關系 為了進一步研究 LINC01296 與 miR?1255b?5p 的相關性，采用 qRT?PCR 檢測 NSCLC 組織中 miR?1255b?5p 的表達水平(圖6a)。與鄰近組織相比，miR?1255b?5p 的表達下調，而 LINC01296 在癌癥樣本中顯著高表達（圖1b）。結果表明，miR?1255b?5p 隨著腫瘤的發(fā)展而降低，其表達趨勢與LINC01296呈負相關(圖 6b)。

圖6 LINC01296與miR?1255b?5p的表達關系

3 討論

本研究旨在探討LINC01296在NSCLC中的作用機制。實驗結果顯示LINC01296 在NSCLC 中高表達。并且，敲低LINC0129會抑制NSCLC細胞生長、遷移。小鼠體內(nèi)實驗也發(fā)現(xiàn)LINC01296低表達對腫瘤生長和轉移有明顯的抑制作用。此外，LINC01296通過miR?1255b?5p海綿吸附作用，促進了肺癌的發(fā)生發(fā)展，二者的表達水平也呈負相關。

近年來，LINC01296 在結直腸癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、膽管癌（CCA）和骨肉瘤中的作用已被研究[11,13-15]。生物信息學分析結果和生存曲線顯示，LINC01296 的高表達與預后不良相關[12]。最新研究發(fā)現(xiàn)，LINC01296 在膠質瘤中表達下調，并通過靶向CARD11 基因和NF?κB 途徑來抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移[15]。LINC01296可能靶向細胞周期蛋白D1，進而促進骨肉瘤的細胞增殖、轉移和細胞周期進展[16]。此外，在膀胱癌中轉染siLINC01296后，膀胱癌細胞的增殖和轉移減少[16]。另外，研究還發(fā) 現(xiàn) microRNA?5095 在 NSCLC 和 CCA 中 與LINC01296 結合的能力很強[13,17]。此外，在 CCA 中，高水平的LINC01296使MYCN的表達被上調。

LINC01296在NSCLC 中的作用機制尚不清楚，其在基因表達中的調控機制也有待進一步研究。另外，miR?1255b?5p 具有抗腫瘤作用，并參與調節(jié)hTERT 介導的上皮?間質轉化[18]。在糖尿病腎病患者中，miR?1255b?5p 表達顯著上調，有望成為診斷糖尿病腎病的生物標志物[19]。同時，還有研究發(fā)現(xiàn)一些microRNA，如miR?221 的表達受到一些lncRNA 的調控，并且這些lncRNA 已經(jīng)被證實與NSCLC的發(fā)生與發(fā)展有著重要關系[20]。

本實驗結果為LINC01296 可作為NSCLC 的促癌分子，其作用機制是通過抑制miR?1255b?5p的表達水平，促進了NSCLC 的發(fā)展。后續(xù)將繼續(xù)研究LINC01296/miR?1255b?5p在NSCLC中的作用機理，如 LINC01296/miR?1255b?5p 的信號通路、miR?1255b?5p 作用的靶基因、LINC01296 表達的調控因子等。這些機制的闡明將為NSCLC 的診斷和藥物開發(fā)的應用提供光明的前景。