李璐，魏旋，劉佳

上海科技大學(xué) 免疫化學(xué)研究所，上海 201210

1 鋅指蛋白的分類及基本結(jié)構(gòu)

鋅指（zinc finger,ZF）廣泛存在于動植物和微生物中，是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子中的重要結(jié)構(gòu)域，對基因表達(dá)的調(diào)控（抑制或激活）起重要作用[1]。鋅指蛋白（zinc finger protein,ZFP）中含有數(shù)量不等的鋅指基序，每一個(gè)鋅指基序通過結(jié)合Zn2+形成穩(wěn)定的類似“手指”的結(jié)構(gòu)，并根據(jù)自身序列及結(jié)構(gòu)特性選擇性地結(jié)合特異性下游靶標(biāo)DNA或RNA來實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)控[2]。根據(jù)鋅指基序序列的特點(diǎn)（主要是半胱氨酸 （Cys） 和組氨酸 （His）的數(shù)量和位置）可將鋅指蛋白分為不同的類別，如Jeremy Berg等[3]劃分的9類鋅指蛋白（圖1）。其中，C2H2型鋅指被稱為經(jīng)典型鋅指，具有同源保守序列：（Tyr,Phe）-X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-6-His（X為可變氨基酸）[4]。

圖1 目前已解析的9類鋅指蛋白結(jié)構(gòu)（黑字為鋅指基序類型，藍(lán)字為代表蛋白質(zhì)，紅字為基序序列）

2 C2H2鋅指結(jié)構(gòu)蛋白在基因編輯中的應(yīng)用

許多人類疾病都直接或間接與遺傳因素有關(guān)?！叭祟惢蚪M計(jì)劃”的完成為人們理解和操縱基因組提供了可能，因此應(yīng)用位點(diǎn)特異性核酸酶對疾病相關(guān)基因序列進(jìn)行修復(fù)逐漸成為疾病治療領(lǐng)域的焦點(diǎn)[5]。目前主要有3種核酸酶被廣泛應(yīng)用：鋅指蛋白核酸酶（zinc-finger nuclease,ZFN）、TALENs和CRISPR-Cas9（表1）。

1996年，約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院的Kim等設(shè)計(jì)并開發(fā)了世界上第一個(gè)ZFN，將能結(jié)合DNA的C2H2鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和 FokI 限制性內(nèi)切酶的核酸酶結(jié)構(gòu)域融合（圖2），通過改變鋅指蛋白的序列改變其識別DNA的特異性，從而實(shí)現(xiàn)其對基因組不同位點(diǎn)的靶向結(jié)合[6]。除與核酸酶元件結(jié)合外，ZFP還可與轉(zhuǎn)錄因子、甲基轉(zhuǎn)移酶等形成融合蛋白，用于基因表達(dá)調(diào)控、表觀修飾等[7]。雖然新型的基因編輯工具層出不窮，但是ZFP因其自身獨(dú)特性質(zhì)（表1），仍被廣泛應(yīng)用于遺傳疾病和傳染性疾病的基因治療中（表2）。2014年3月，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》首次報(bào)道了應(yīng)用ZFN進(jìn)行基因治療的臨床研究，結(jié)果表明，經(jīng)ZFN改造后的CD4+T細(xì)胞對HIV病毒具有抵抗作用[8]。

表1 常用基因編輯工具比較

表2 已注冊的鋅指蛋白相關(guān)基因治療的臨床研究

圖2 ZFN特異性識別、剪切DNA的原理示意圖

目前，鋅指蛋白基因治療的領(lǐng)軍企業(yè)為美國的生物技術(shù)公司Sangamo Therapeutics（納斯達(dá)克上市企業(yè)），其管線包括1個(gè)臨床III期、4個(gè)臨床I/II期以及數(shù)個(gè)臨床前的研究內(nèi)容，疾病類型涵蓋遺傳性疾病、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤等。

3 C2H2鋅指蛋白細(xì)胞穿透特性的發(fā)現(xiàn)與研究

2012年，Scripps研究所的Barbas課題組率先探索了利用純化的位點(diǎn)特異性核酸酶蛋白質(zhì)進(jìn)行的基因編輯技術(shù)，發(fā)現(xiàn)純化的ZFN蛋白質(zhì)在與哺乳動物細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)能自發(fā)穿過細(xì)胞膜并對靶基因進(jìn)行高效突變[9]。與采用ZFN編碼質(zhì)粒進(jìn)行的基因編輯技術(shù)相比，純化的ZFN蛋白質(zhì)能顯著降低脫靶效率，從而提升基因編輯的特異性。這種基于核酸酶蛋白質(zhì)的基因編輯體系被迅速推廣至其他核酸酶工具，如TALEN[10]和CRISPRCas9[11]。

進(jìn)一步的研究表明，ZFN的細(xì)胞穿透特性來源于其ZFP結(jié)構(gòu)域[9]。在此基礎(chǔ)上，Gaj和劉佳等[12]對ZFP的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了工程化改造，使其結(jié)合DNA的氨基酸突變?yōu)楸彼幔瑥亩辉俳Y(jié)合DNA，而作為蛋白質(zhì)遞送的載體。研究發(fā)現(xiàn)，ZFP可有效地將融合蛋白質(zhì)“貨物”遞送至哺乳動物細(xì)胞中。同時(shí)，與傳統(tǒng)的細(xì)胞穿膜肽（cellpenetrating peptide,CPP）相比，ZFP具有更高的細(xì)胞穿透效率及細(xì)胞類型的廣譜性[12]。對ZFP細(xì)胞穿透機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)，ZFP的穿膜過程是能量依賴的，且主要通過巨胞飲作用（macropinocytosis）和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞（caveolin-dependent endocytosis）完成[12]。更重要的是，ZFP可以高效地逃逸出內(nèi)體（endosome），這保證了“貨物”蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的有效釋放（圖3）。

圖3 ZFP的穿膜機(jī)制研究

4 C2H2鋅指蛋白在藥物遞送方面的FTO分析

細(xì)胞膜的選擇性通透作用，在給細(xì)胞提供保護(hù)的同時(shí)，也使得許多大分子藥物（如核酸、多肽、抗體、酶）無法有效進(jìn)入細(xì)胞。一般認(rèn)為，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)只占到全部基因組編碼蛋白的2/3（Uniprot數(shù)據(jù)庫）。因此，具有細(xì)胞穿透特性的大分子藥物相比于傳統(tǒng)大分子藥物，具有更廣闊的藥物靶點(diǎn)選擇空間。目前，將大分子藥物遞送至細(xì)胞中的方法多種多樣，如脂質(zhì)體、顯微注射、電穿孔、病毒載體等[13]。這些方法雖然各有優(yōu)勢，但也存在一些共性和方法特異性的問題，如制備工藝復(fù)雜、細(xì)胞穿透效率低、細(xì)胞毒性高、免疫原性高、內(nèi)體逃逸效率低、細(xì)胞類型受局限等[14-15]。

CPP作為大分子物質(zhì)的細(xì)胞遞送工具，無論對基礎(chǔ)研究[16]還是疾病治療[17]都必不可少，具有十分廣闊的應(yīng)用前景[18]。CPP的類型多種多樣，而國際上從事C2H2鋅指蛋白遞送工具研究的主要為上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所的劉佳團(tuán)隊(duì)。對C2H2鋅指蛋白進(jìn)行自由實(shí)施（freedom-to-operate,FTO）分析可發(fā)現(xiàn)，目前相關(guān)的專利均為藥物蛋白（分子）專屬性的專利（表3），尚未存在平臺性質(zhì)的專利，因此C2H2鋅指蛋白遞送領(lǐng)域仍存在進(jìn)行創(chuàng)新藥物研發(fā)的“入場空間”。

表3 C2H2鋅指蛋白相關(guān)專利列表

5 C2H2鋅指蛋白在藥物遞送方面的應(yīng)用實(shí)例分析

ZFP對目前測試的所有類型細(xì)胞都表現(xiàn)出高效的運(yùn)輸效率，其中包括A431、U2OS、MDA-MB-231、DU145等癌癥細(xì)胞株，以及人原代皮膚成纖維細(xì)胞[12]、原代CD4+T細(xì)胞及CD34+造血干/祖細(xì)胞[19]。在早期研究中，Gaj和劉佳等[12]發(fā)現(xiàn)，ZFP可將模式蛋白綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）遞送至真核細(xì)胞，且遞送效率與ZFP串聯(lián)的數(shù)量有一定關(guān)系。同時(shí)，ZFP可將模式蛋白熒光素酶遞送至細(xì)胞中，證明ZFP不會使運(yùn)輸?shù)摹柏浳铩钡鞍资Щ頪12]。此外，ZFP還應(yīng)用于一系列具有藥物價(jià)值或治療價(jià)值的蛋白質(zhì)上。

5.1 ZFP對基因編輯核酸酶FokI的細(xì)胞遞送

在發(fā)現(xiàn)純化的ZFN蛋白質(zhì)（ZFP-FokI融合蛋白）具有細(xì)胞穿透特性之后[9]，劉佳團(tuán)隊(duì)對ZFN蛋白質(zhì)的制備工藝進(jìn)行了改進(jìn)：通過優(yōu)化蛋白質(zhì)純化條件，可擺脫包涵體純化ZFN蛋白質(zhì)的方案，而用細(xì)胞裂解上清進(jìn)行純化。同時(shí)，研究人員還對ZFN蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行工程化改造：在ZFN的N端連接多個(gè)核定位信號（nuclear localization signal,NLS）。這些改進(jìn)極大提升了ZFN蛋白質(zhì)在原代CD4+T細(xì)胞上的基因編輯效率，將3次處理才能對CCR5實(shí)現(xiàn)8%的敲除效率提升至1次處理即實(shí)現(xiàn)20%以上的敲除效率；同時(shí)，可對CCR5和CXCR4進(jìn)行高效的雙敲除，用于構(gòu)建HIV抵抗性的CD4+T細(xì)胞[19]。

5.2 ZFP對乳鐵蛋白的細(xì)胞遞送

人乳鐵蛋白是分子量約為80 kD的鐵結(jié)合糖蛋白，主要存在于哺乳動物的乳汁及部分外分泌液中，具有促進(jìn)腸道鐵吸收、抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物學(xué)功能。乳鐵蛋白不僅被廣泛用于日常生活，也被用于治療各種疾病[20]。目前，乳鐵蛋白相關(guān)的疾病包括傳染性疾病（如COVID-19）、癌癥（如腎癌）、代謝紊亂（如腹瀉）等。乳鐵蛋白主要是以口服的方式被使用。特異性的乳鐵蛋白受體分布于人的小腸、肝臟、骨和腦組織中，在小腸中的分布最為廣泛[21]。由于受體分布相對單一，乳鐵蛋白在作為營養(yǎng)品或藥品時(shí)的吸收效果或生物利用率并不理想。劉佳與其合作者的研究發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白-人乳鐵蛋白融合蛋白（ZFP-hLF）可在保有乳鐵蛋白抗氧化和抗菌活性的基礎(chǔ)上，具有高效的細(xì)胞穿透效率，在人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6中的吸收效率提升了40倍左右[20]。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對提升乳鐵蛋白的臨床治療效果具有重要意義。

5.3 ZFP對超氧化物歧化酶的細(xì)胞遞送

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）家族包括一系列經(jīng)充分研究的抗氧化酶，即SOD1、SOD2和SOD3[22]。SOD在減弱來自細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）的氧化應(yīng)激中起基礎(chǔ)作用。ROS的紊亂會導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生和發(fā)展[22-23]，而臨床前和臨床研究均表明SOD對ROS紊亂具有很好的治療前景[24]。SOD已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療，例如缺血再灌注損傷[25]、移植誘導(dǎo)再灌注損傷[26]、炎癥[27]、帕金森病[28]、腫瘤[29-30]和獲得性免疫缺陷綜合征[31]。劉佳和合作者完成了ZFP-SOD1融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)、純化及細(xì)胞活性測試，并證明ZFP可比其他CPP更有效地遞送SOD1進(jìn)入真核細(xì)胞，同時(shí)可將天然折疊狀態(tài)下的SOD1活性形式遞送至細(xì)胞中[32]。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步擴(kuò)展SOD的治療潛力提供了有力支撐。

6 總結(jié)與展望

ZFP從發(fā)現(xiàn)至今，一直是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)之一。人們發(fā)現(xiàn)了多種ZFP，并對它們的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和細(xì)胞穿透機(jī)制等進(jìn)行深入研究。在本文中，我們總結(jié)了C2H2ZFP作為藥物遞送工具的相關(guān)研究，并分析了ZFP遞送技術(shù)相關(guān)的專利情況。目前，雖尚未有C2H2ZFP相關(guān)的藥物進(jìn)入臨床研究或獲批上市，但為未來相關(guān)技術(shù)或藥物的研發(fā)提供了想象空間。同時(shí)，對ZFP細(xì)胞穿透機(jī)理更深入的解析，也將有助于研發(fā)/優(yōu)化新一代ZFP大分子藥物遞送工具。