張海鷗，楊鑫蕾，尉建，嵇冶

（長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

隨著工業(yè)的發(fā)展，工廠所排放的大量甾體類化合物，對人類和動物的生長發(fā)育帶來巨大的危害［1-2］：如引發(fā)人類不孕不育、生殖疾病、腫瘤及生物變性等嚴(yán)重問題［3］。近年科學(xué)家在自然界發(fā)現(xiàn)了屬于叢毛單胞菌屬的睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonastestosteroni，CT）ATCC11996，它 是以甾體作為唯一碳源的革蘭氏陰性細(xì)菌，并以甾體激素作為碳源和能源物質(zhì)，進(jìn)行代謝活動。在之前的研究中已報(bào)道了CT的基因組序列，并描述和表征了幾種甾體代謝酶與甾體結(jié)合的反應(yīng)過程［4］。CT菌分解甾體激素的過程錯綜復(fù)雜，一共有幾十種酶先后共同參與了它的代謝過程［5］，SDR短鏈脫氫酶就是眾多代謝酶家族中的一員。

過去研究表明LuxR、LysR、TetR蛋白對睪丸酮叢毛單胞菌（CT菌）中的很多脫氫酶具有調(diào)控作用［6-8］，它們可以與短鏈脫氫酶及甾體激素互相結(jié)合并對甾體激素進(jìn)行降解。因此研究CT菌中SDRx脫氫酶的調(diào)控作用具有重要的研究價值。本研究采用基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化、ELISA、高效液相等方法，研究這三種蛋白對SDRx的調(diào)控作用，從而為更好的利用CT菌修復(fù)環(huán)境中甾體激素的污染的研究做貢獻(xiàn)，可為睪丸酮叢毛單胞菌在自然界中甾體激素的生物降解及基因調(diào)控研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)［9-12］。

1 實(shí)驗(yàn)材料

CT菌，pCR2.1-TOPO自殺質(zhì)粒由德國基爾大學(xué)熊光明教授惠贈。質(zhì)粒小提試劑盒來自上海Songon公司，DNA凝膠回收試劑盒來自北京TIAN GEN公司，睪丸酮、孕酮、雌酮、17a-乙炔基雌二醇、甲睪酮均來自德國Dr.Ehrenstorfer公司，羊抗鼠抗體來自上海Chemicon公司。大腸桿菌DH5α為實(shí)驗(yàn)室保存，pK18、pUC19質(zhì)粒均為實(shí)驗(yàn)室所有；重組質(zhì)粒pUC19-LuxR為實(shí)驗(yàn)室保存。所用化學(xué)試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 SDRx基因位點(diǎn)及其引物設(shè)計(jì)

SDRx基因?qū)儆?-氧?；?（?；d體蛋白）還原酶（3-oxoacyl-［acyl-carrier-protein］-reduc‐tase）一員，以NAD+或NADP+為受體、作用于供體CH-OH基團(tuán)上的氧化還原酶，如圖1所示，它位于 glutathione-dependent formaldehy-de-activating下游344 kb處，在CT菌基因組中具有相同的轉(zhuǎn)錄方向。作為SDR超家族的一員，該SDR基因包含SDR的共同序列基序，N末端Gly-XXX-Gly-XGly輔因子結(jié)合基序和Tyr-XXX-Lys區(qū)段。

圖1 SDRx基因位點(diǎn)

2.2 SDRx敲除菌株構(gòu)建及活性測定

參照張昊等人［13-14］的方法，設(shè)計(jì)SDRx基因201-500bp中心部位的敲除引物時，在上游第三、四堿基之間加入G（P1）并在下游末端引入終止子TAA（P2），引物列表如表1所示，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR片段克隆至pCR2.1-TOPO中，得到pCR2.1-TOPO-SDR300，電轉(zhuǎn)到CT菌感受態(tài)細(xì)胞中，27℃，180 rpm條件下置于Amp+/Kan+雙抗平板，得到多個SDRx敲除株，利用P1和TOPO質(zhì)粒的敲除通用驗(yàn)證引物（P3），以敲除株基因組為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證。利用基因同源重組將目的基因?qū)隒T菌基因組中，由于TOPO質(zhì)粒的自殺特性和引物加G進(jìn)行移碼突變從而達(dá)到基因敲除目的。

用終濃度為 0.5 μmol/L的睪丸酮（T）、孕酮（P）、雌酮（ES）、雌二醇（E2）、甲睪酮（ME），對野生型、敲除株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并設(shè)置空白對照組（相同培養(yǎng)基體系下只加入等濃度的激素不加菌液）。每種激素在27℃，180 rpm/min條件下誘導(dǎo)16 h，用等體積的氯仿萃取，重復(fù)3次，收集氯仿后通風(fēng)櫥中晾干，分別溶于1 mL甲醇作為樣品，島津液相色譜儀進(jìn)行HPLC分析。檢測波長分別為雌二醇280 nm；睪丸酮280 nm；孕酮280 nm；甲睪酮208 nm；雌酮241 nm；流動相水與甲醇的比為20∶80；每次進(jìn)樣50 μL；色譜柱的溫度為40℃。

2.3 SDRx脫氫酶表達(dá)載體構(gòu)建及目的活性蛋白的表達(dá)純化

以野生型CT菌基因組為模板進(jìn)行PCR得到目的基因片段SDRx，擴(kuò)增引物P4、P5（見表1）。連接至pET-15b載體上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pETSDRx，轉(zhuǎn)入至表達(dá)菌株 BL21（DE3）中，得到疑似陽性克隆子并進(jìn)行測序及雙酶切驗(yàn)證，無突變成功構(gòu)建表達(dá)工程菌。

表1 引物設(shè)計(jì)

對pET-15b和pET-SDRx進(jìn)行大量表達(dá)，在IPTG終濃度0.8 mmol/L條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，16℃，110 rpm，恒溫震蕩培養(yǎng)24 h。分別收取菌液后，PBS重懸3次，凍融超聲，鎳柱純化獲得目的蛋白，將所得蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

2.4 SDRx蛋白多克隆抗體的制備及效價測定

取得小鼠陰性血清后，對其進(jìn)行特異性免疫。將上述工程蛋白過濾，分三次進(jìn)行免疫，第一次免疫將工程蛋白與完全弗氏佐劑1∶1混合，第二、三次免疫將工程蛋白與不完全弗氏佐劑1∶1混合，每次免疫間隔時間為一周，完成第三次免疫后，進(jìn)行眼球取血，得到陽性血清。

ELISA法測定SDRx小鼠多克隆抗體效價，加入陰性血清為陰性對照（N），加入抗原作為陽性標(biāo)準(zhǔn)（P），P/N>2.1時該比例為抗體效價。將抗原稀釋至2 μg/mL 37℃包被1 h，洗滌液清洗3次后，每孔加入100 μL（1∶8 000），37 ℃包被1 h；洗滌3次，每孔加入100 μL Chemicon公司購得的二抗羊抗鼠（1∶4 000）37 ℃包被1 h，洗滌液清洗5次，去離子水洗滌2次，加入TMB應(yīng)用液作為顯色液避光包被30 min，加入終止液后，酶標(biāo)儀450 nm波長測OD值，空白對照為490 nm。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到線性回歸方程y=0.068 1 ln（x）+0.270 7，R2=0.999 5，得到最終抗體效價為1∶800 0。

2.5 三種調(diào)控蛋白對SDRx脫氫酶調(diào)控作用的研究

參照熊光明的實(shí)驗(yàn)方法［15］，引物設(shè)計(jì)如表1（P6-P11）所示，將LysR、TetR的PCR片段分別轉(zhuǎn)入pUC19；SDRx與在其前端107bp的預(yù)測啟動子區(qū)域（107SDRx）片段轉(zhuǎn)入pK18，活化實(shí)驗(yàn)室保存的pUC19-LuxR菌種。向HB101感受態(tài)細(xì)胞中加入等濃度pK18-107SDRx質(zhì)粒與pUC19-LysR質(zhì)粒，重組為LysR共轉(zhuǎn)株，命名“pLysR”；pK18-107SDRx質(zhì)粒與pUC19-TetR質(zhì)粒，重組為TetR共轉(zhuǎn) 株 ，命 名“pTetR”；pK18-107SDRx質(zhì) 粒 與pUC19-LuxR質(zhì)粒，進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，重組為LuxR共轉(zhuǎn)株，命名“pLuxR”。Amp+/Kan+雙抗平板篩選出多個陽性克隆子，并以其基因組為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，成功構(gòu)建共轉(zhuǎn)化菌株。以睪丸酮為誘導(dǎo)激素，取上述陽性克隆子活化擴(kuò)大后，加入終濃度 0.5 μmol/L睪丸酮，37℃ 180 rpm條件下誘導(dǎo)14 h，提取總蛋白，設(shè)置對照組與平行試驗(yàn)組各三組，對照組為相同體系下無水乙醇進(jìn)行誘導(dǎo)的重組菌株，平行試驗(yàn)組分別為相同體系下終濃度為0.5 μmol/L的孕酮、睪丸酮進(jìn)行誘導(dǎo)的重組菌株，分別提取總蛋白，方法參照2.3部分。

將所得蛋白稀釋至1 mg/mL進(jìn)行包被，野生型總蛋白稀釋為2 mg/mL進(jìn)行包被。上述抗體以1∶8 000的效價進(jìn)行一抗包被。ELISA方法詳細(xì)步驟參照上述2.4.實(shí)驗(yàn)部分。將抗原稀釋至2 μg/mL 37℃包被1 h，洗滌液清洗3次后，每孔加入 100 μL（1∶8 000），37 ℃包被 1 h；洗滌 3次，每孔加入100 μL Chemicon公司購得的二抗羊抗鼠（1∶4 000）37℃包被1 h，洗滌液清洗5次，去離子水洗滌2次，加入TMB應(yīng)用液作為顯色液避光包被30 min，加入終止液后，酶標(biāo)儀450 nm波長測OD值，空白對照為490 nm。利用t檢驗(yàn)及方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對三組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將LysR、LuxR、TetR重組共轉(zhuǎn)質(zhì)粒與pUC19重組共轉(zhuǎn)質(zhì)粒分組后對其顯著性差異進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 SDRx基因突變株（M-CT）鑒定

如圖2原理圖所示，利用基因同源重組將目的基因?qū)隒T菌基因組中，由于TOPO質(zhì)粒的自殺特性和引物加G進(jìn)行移碼突變從而達(dá)到基因敲除目的。SDRx敲除株P(guān)CR鑒定如圖3可知，1道以M-CT基因組為模板，在530 bp處有明亮單一條帶，而相應(yīng)2道以野生型CT為模板并未出現(xiàn)對應(yīng)條帶，證明SDRx基因的敲除株M-CT構(gòu)建成功。

圖2 SDRx敲除原理圖

圖3 SDRx敲除株P(guān)CR鑒定圖

3.2 高效液相數(shù)據(jù)分析

高效液相結(jié)果如圖4可知，為野生型CT與敲除株M-CT的三組平行實(shí)驗(yàn)均值，加入終濃度為0.5 μmol/L的不同種類甾體激素，其中敲除突變株在各激素培養(yǎng)條件下，降解量均明顯少于野生型，SDRx基因敲除后其降解激素的能力受到了很大的影響，柱狀圖顯示了CT菌中SDRx敲除后，對不同激素的降解能力影響程度為睪丸酮>甲睪酮>孕酮>雌酮>雌二醇。

圖4 野生型及敲除株激素降解量數(shù)據(jù)圖

3.3 SDRx目的蛋白的表達(dá)純化結(jié)果圖

利用上述方法構(gòu)建SDRx表達(dá)載體，將疑似陽性克隆子質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切并送由庫美公司進(jìn)行測序鑒定，基因序列未發(fā)生突變，并將陽性克隆子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）p-LysS中，得到正確無突變的pET-SDRx-BL21（DE3）表達(dá)菌株。

經(jīng)軟件Protein Molecular Weight對SDRx的查詢計(jì)算，帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白分子量為29.2 kDa。如圖5所示，第10泳道為NPI-200下洗脫的目的蛋白，條帶清晰大小準(zhǔn)確為29.2 kDa，純化效果良好。

圖5 SDRx蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳表征結(jié)果圖

3.4 LysR，LuxR，TetR三種調(diào)控因子重組質(zhì)粒驗(yàn)證

圖6為pK18-107SDRx上啟動子和SDRx基因的結(jié)構(gòu)示意圖。圖7為以上述構(gòu)建成功的pK18-107SDRx分別與pUC19-LysR/LuxR/TetR的共轉(zhuǎn)菌株基因組為模板的PCR驗(yàn)證結(jié)果，其中1道的LysR為912 bp；2道的LuxR為1 125 bp；3道的TetR為660 bp，均為理想數(shù)值，即表明成功構(gòu)建了三種共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。

圖6 pK18-107SDRx上啟動子和SDRx基因的結(jié)構(gòu)示意圖

圖7 LysR，LuxR，TetR重組質(zhì)粒PCR鑒定

3.5 三種調(diào)控蛋白對SDRx脫氫酶調(diào)控作用的結(jié)果圖

由3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即野生型CT菌對睪丸酮、甲睪酮及孕酮三種激素的降解能力較好，本實(shí)驗(yàn)選取了較有代表性的睪丸酮和孕酮作為底物，如圖8所示。利用t檢驗(yàn)及方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對三組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將LysR、LuxR、TetR重組共轉(zhuǎn)質(zhì)粒與pUC19重組共轉(zhuǎn)質(zhì)粒分組后對其顯著性差異進(jìn)行分析。與無調(diào)控蛋白的共轉(zhuǎn)化菌株（pUC19空白對照組）數(shù)據(jù)對比，LysR調(diào)控蛋白在兩種激素條件下對SDRx脫氫酶的表達(dá)量基本不變；LuxR和TetR調(diào)控蛋白在兩種激素條件下對SDRx脫氫酶的表達(dá)起促進(jìn)作用，且睪丸酮誘導(dǎo)條件下的促進(jìn)作用尤為顯著，其中睪丸酮條件下TetR的促進(jìn)作用更明顯大于LuxR。

圖8 三種調(diào)控蛋白共轉(zhuǎn)菌株中SDRx蛋白的表達(dá)情況

4 結(jié)論與展望

本研究中的降解激素結(jié)果表明：敲除株對甾體類激素的降解能力均呈現(xiàn)出不同程度的減弱而不是完全喪失，這與之前發(fā)表的BKR，AKR，LuxR等基因敲除株［16-17］出現(xiàn)的情況相類似?？赡苁怯捎贑T菌本身有一些同工酶或代償途徑，使得SDRx基因被敲除后，也會有其他途徑（或酶）來完成激素降解，表現(xiàn)為其降解能力的減弱而不是消失。

LysR，LuxR，TetR分別對SDRx的調(diào)控結(jié)果可以得出如下結(jié)論：（1）在誘導(dǎo)物為睪丸酮時：與無調(diào)控蛋白的共轉(zhuǎn)菌株（pUC19空白對照組）相比，“pTetR”的SDRx表達(dá)量提高了5.3倍，明顯表現(xiàn)為正向促進(jìn)作用；“pLuxR”的SDRx表達(dá)量提高了2.1倍，增加并不明顯，但仍有正向促進(jìn)調(diào)控作用；而“pLysR”的SDRx表達(dá)量則降低了0.3倍，可忽略不計(jì)，表明沒有調(diào)控作用；（2）當(dāng)誘導(dǎo)物為孕酮時，與無調(diào)控蛋白的共轉(zhuǎn)菌株（pUC19空白對照組）相比，“pTetR”的SDRx表達(dá)量提高了1.6倍，表現(xiàn)為正向促進(jìn)作用，但效果明顯低于在睪丸酮的條件下；“pLuxR”、“pLysR”的 ELI‐SA結(jié)果對比無調(diào)控蛋白的共轉(zhuǎn)菌株（pUC19空白對照組）分別為提高了的0.58倍、降低了0.08倍，數(shù)值較小可忽略不計(jì)，沒有表現(xiàn)出調(diào)控作用。

在前人的工作中證明了CT菌中某些調(diào)控蛋白可以與誘導(dǎo)物、被調(diào)控基因三者之間的相互作用關(guān)系，并構(gòu)建了動態(tài)調(diào)控模型［15］，而本實(shí)驗(yàn)中又進(jìn)一步證明了TetR能夠?qū)DRx脫氫酶產(chǎn)生正調(diào)控。目前，對CT菌中甾體激素的全部代謝網(wǎng)絡(luò)尚處于逐漸了解的過程中，在今后的工作中，隨著研究的不斷深入，還有幾個問題亟需解決：（1）TetR作為調(diào)控蛋白，如何結(jié)合到SDRx的調(diào)控區(qū)？（2）作為誘導(dǎo)物的睪丸酮如何結(jié)合到TetR蛋白上？結(jié)合位點(diǎn)在哪里？這個結(jié)合中心空間大小與睪丸酮（孕酮）分子是否匹配？（3）睪丸酮和孕酮在作為誘導(dǎo)物時，三種調(diào)控蛋白分別與SDRx共轉(zhuǎn)化后的ELISA結(jié)果所表現(xiàn)出的差異，是否是由于其與誘導(dǎo)物結(jié)合中心的匹配效果不同所引起的？（4）用分子互做的方法來檢測TetR蛋白與睪丸酮分子的親和常數(shù)是多少？（5）當(dāng)TetR蛋白結(jié)合了睪丸酮后，它與SDRx基因的結(jié)合區(qū)又是否會產(chǎn)生變化？（6）CT菌中有大量的調(diào)控基因存在，TetR調(diào)控蛋白是否會與其他調(diào)控蛋白共同作用于SDR家族并對其產(chǎn)生調(diào)控？（7）所用的檢測方法是否可以應(yīng)用于環(huán)境中甾體類激素的微量檢測等。隨著研究的深入，可以更好地了解分析CT菌的代謝作用機(jī)理，構(gòu)建出安全可靠、降解能力更強(qiáng)大的基因工程菌株。