池曉蓉 陳德招 王趙偉 李敏 姜艷玲

(1.廈門大學附屬第一醫(yī)院婦產科，福建 廈門 361000;2.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院婦產科，福建 福州 350001；3.中國制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006)

子宮出血是指與月經無關的子宮異常出血，是臨床常見的婦科疾病[1-2]。子宮異常出血可導致子宮內膜病變、貧血甚至不孕等，其發(fā)病率較高，嚴重危害女性生命健康[3-4]。子宮出血機制復雜，近年來研究發(fā)現，子宮出血與子宮內膜上皮細胞凋亡、血管生成障礙、胞外基質異常及激素水平異常等子宮局部微環(huán)境改變有關[5-6]。而磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B (Protein kinase B,Akt)可調控細胞生長、增殖、凋亡，且與血管生成關系密切[7-8]，但PI3K-Akt通路在子宮出血病理過程中的調控作用研究較少。中醫(yī)藥在治療子宮出血方面有其獨特優(yōu)勢，榆梔止血顆粒(Yuzhi Zhixue Granule,YZZXKL)原名婦科止血顆粒，具有清熱涼血、調經止血，臨床上常用于治療血熱所致的月經過多，有文獻報道發(fā)現在早孕子宮出血癥方面止血效果較好[9]。然而YZZXKL治療子宮出血的具體機制還不明確，這不利于YZZXKL的推廣和應用，本研究通過建立大鼠子宮出血模型并設置PI3K-Akt通路抑制劑對此進行研究，以期闡明PI3K-Akt通路在YZZXKL治療子宮出血中的作用，為臨床合理用藥及中醫(yī)藥走向國際化提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級同遺傳背景SD大鼠，體重 260～280 g,由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK(粵)2018-0002。所有大鼠于本院動物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%，噪音低于80分貝，保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本試驗經本院倫理委員會批準，試驗動物符合3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 YZZXKL(成藥組成：地榆、梔子、墨旱蓮、黃芩、茜草、貫眾、槐花、蒲黃、拳參、大薊、丹皮、白芍、側柏葉(炒炭)、仙鶴草、當歸等，批號：2003L01364,由山東新時代藥業(yè)有限公司生產，規(guī)格：10 g/袋，國藥準字Z20130019)；蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin Staining,HE)染色試劑盒(貨號：LMO105,廠家：上海聯邁生物工程有限公司)；米非司酮(貨號：10412,購自北京凱瑞基生物科技有限公司)；米索前列醇片(貨號：RK170327,購自深圳市洛克生化科技有限公司)；血清雌二醇(E2)、孕酮(P)酶聯免疫(Enzyme linked immunosorbent assay,ELSA)試劑盒(貨號：YE01847、YE01938,均購自上海遠慕生物科技有限公司)；PI3K抗體、Akt磷酸化p-Akt抗體、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶(MMP-1)、(貨號分別為：ab39307、ab38449、ab19956、ab32152、ab134184,均購自美國abcam公司)；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(貨號分別為P0768,P0231,均購自美國Pierce 公司)。手動輪轉式切片機(型號RM2125RTS,德國Leica公司)；光學顯微鏡(型號SMZ745,日本尼康公司)；蛋白電泳儀、半干轉膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD,美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(型號：GIS-500,Miulab公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠子宮出血模型建立及分組給藥 參照文獻[9]建立大鼠子宮出血模型，具體操作方法為：將健康雌性SD大鼠80只、雄性大鼠40只，按2∶1比例合籠飼養(yǎng)，于第2天8∶00進行陰道涂片檢查，以發(fā)現精子為妊娠第1天，取妊娠大鼠60只，隨機分為正常對照組(Normal組)、模型組(Model組)、YZZXKL低(4 g/kg)、高(16 g/kg)劑量組、PI3K/Akt通路抑制劑LY294002組(LY組，0.3 mg/kg)、YZZXKL+LY組(16 g/kg+0.3 mg/kg)，各組10只。除Normal組外，其余各組大鼠均于妊娠第7天8∶00和18∶00時分別灌服米非司酮(13.8 mg/kg)和米索前列醇(135 μg/kg)復制子宮出血模型，并于大鼠陰道置于棉球，若次日取出棉球觀察，若棉球上有血，表明造模成功；Normal組于相同時間灌胃給予等量生理鹽水。各組大鼠均于造模成功后(妊娠第8 d)開始給藥，YZZXKL參照文獻[9]及人與動物等效劑量換算設置低、高劑量組，并用生理鹽水稀釋成0.4、1.6 g/mL的混懸液，LY294002參照文獻[10]用DMSO溶液配制為0.03 mg/mL的混懸液，YZZXKL低、高劑量組按10 mL/kg的劑量灌胃給予相應濃度的YZZXKL混懸液；LY組按10 mL/kg的劑量腹腔注射給予相應濃度的LY294002混懸液；YZZXKL+LY組按10 mL/kg的劑量灌胃給予YZZXKL混懸液和腹腔注射給予LY294002混懸液；Normal組和Model組均按10 mL/kg的劑量灌胃給予生理鹽水，并腹腔注射給予DMSO溶液。各組連續(xù)給藥7 d,1次/d。

1.2.2 大鼠陰道出血量(UBQ)測定 各組大鼠均參照文獻[9]在給藥期間(妊娠第8 d～14 d)于陰道內置入重量為75～80 mg棉球一個(塑料薄膜包裹半側，以防血液漏出和尿液返流)，次日分別于8∶00和18∶00將棉球取出，放入塑料袋中密閉冷藏保存，同時置換一個新棉球于陰道內，觀察陰道出血情況。將各組大鼠每天收集的子宮出血棉球分別置于燒杯內，根據出血量的情況加適量50 g/L NaOH浸泡擠壓、搓洗棉球血漬，浸洗后的溶液倒入一燒杯內保存。并用50 g/L NaOH浸洗3～4次，收集所有浸洗液，混勻，并記錄所用50 g/L NaOH總體積，取5 mL浸提液過濾，取4 mL濾液，作為試驗管。用血紅蛋白吸管，吸取大鼠尾靜脈血0.02 mL,加入50 g/L NaOH溶液4 mL,混勻作為空白對照管。將空白管和對照管在546 nm波長記錄吸光度(A)值，根據公式子宮出血量(mL)=0.02×浸提液A值×浸提子宮血所用NaOH總體積(mL)/空白管A值/4,計算陰道出血量(UBQ)。

1.2.3 大鼠血液指標檢測及子宮組織標本采集 各組大鼠在末次給藥24 h后，用3%戊巴比妥鈉麻醉，取頸總動脈血6 mL (不加抗凝劑)，全血以3000 r/min離心10 min,取上層血小板血漿 (PPP)用半自動凝血分析儀按照凝血四項說明書測定凝血四項，另取全血2 mL,靜置30 min后以 3000 r/min 離心10 min,取上清液按ELISA試劑盒說明書檢測血清E2、P含量。處死大鼠，取子宮組織，剪取0.5 g子宮內膜組織，用組織勻漿器勻漿、離心分離后取上清液于-20 ℃冰箱保存；剩余子宮組織，迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HE染色觀察子宮組織形態(tài)變化 取1.2.3于4%多聚甲醛中固定的子宮內膜組織，進行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片。按HE試劑盒說明書進行染色，置于顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化。

1.2.5 Western blot法檢測子宮內膜組織中PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-1、bFGF蛋白相對表達水平 取1.2.3于-20 ℃冰箱保存的子宮內膜組織勻漿液，于4 ℃冰箱中解凍后，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，蛋白定量BCA試劑盒檢測蛋白總濃度后，取50 μg蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h,TBST溶液清洗3次后，加入一抗(PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-1、bFGF、稀釋倍數分別為1∶1000)、β-actin(內參，稀釋倍數為1:2000)抗體，4 ℃搖床室溫孵育過夜，TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數1∶2000)，37 ℃搖床室溫孵育1 h,TBST清洗3次后，采用增強化學發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

2 結果

2.1 各組大鼠UBQ及血清激素E2、P含量檢測結果 與Normal組相比，Model組和YZZXKL+LY組大鼠UBQ明顯增高 (P<0.05)，E2、P含量均降低(P<0.05)。與Model組和YZZXKL+LY組相比，YZZXKL低、高劑量組大鼠大鼠UBQ均明顯降低(P<0.05)，E2、P含量均升高 (P<0.05)，且YZZXKL各劑量組上述指標呈劑量依賴性；而LY組大鼠UBQ明顯增高 (P<0.05)，E2、P含量均降低 (P<0.05)。Model組和YZZXKL+LY組相比，上述指標均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠UBQ及血清激素E2、P含量比較Table 1 Comparison of UBQ,E2 and P contents in serum of rats in each group

2.2 各組大鼠凝血指標TT、PT、APTT及FIB檢測結果 與Normal組相比，Model組和YZZXKL+LY組大鼠TT、PT、APTT均明顯升高 (P<0.05)，FIB降低 (P<0.05)。與Model組和YZZXKL+LY組相比，YZZXKL低、高劑量組大鼠TT、PT、APTT均明顯降低 (P<0.05)，FIB升高 (P<0.05)，且YZZXKL各劑量組上述指標呈劑量依賴性；而LY組大鼠TT、PT、APTT均明顯升高 (P<0.05)，FIB降低 (P<0.05)。Model組和YZZXKL+LY組相比，上述指標均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠TT、PT、APTT及FIB比較Table 2 Comparison of TT,Pt,APTT and FIB of rats in each group

2.3 各組大鼠子宮組織HE染色結果 Normal組大鼠子宮組織結構正常。與Normal組相比，Model組和YZZXKL+LY組大鼠子宮內膜固有層間質細胞增生、血管擴張、間質纖維化及炎性細胞浸潤明顯。與Model組和YZZXKL+LY組相比，YZZXKL低、高劑量組大鼠子宮內膜組織固有層基質細胞略有增生，可見少量新生血管生成，炎性細胞浸潤明顯減輕。而LY組大鼠子宮內膜上皮柱狀細胞變性壞死，凋落，固有層纖維樣變性和增生及血管擴張嚴重，可見明顯的炎性細胞浸潤至肌層，見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織HE染色圖(400×)Figure 1 HE staining of uterus in each group

2.4 各組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表達結果 與Normal組相比，Model組和YZZXKL+LY組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF蛋白相對表達水平均降低 (P<0.05)，MMP-2蛋白表達升高 (P<0.05)。與Model組和YZZXKL+LY組相比，YZZXKL低、高劑量組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF相對表達水平均升高 (P<0.05)，MMP-2蛋白表達降低 (P<0.05)，且YZZXKL各劑量組上述指標呈劑量依賴性；而LY組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF蛋白相對表達水平均降低 (P<0.05)，MMP-2蛋白表達升高 (P<0.05)。Model組和YZZXKL+LY組相比，上述指標均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3、圖2。

圖2 各組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表達免疫印跡圖Figure 2 Western blotting of PI3K,p-Akt,eNOS,VEGF and MMP-2 protein expression in uterine tissue of rats in each group注：A.Normal組；B.Model組；C.YZZXKL+LY組；D.YZZXKL低劑量組；E.YZZXKL高劑量組；F.LY組

表3 各組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表達比較 Table 3 Comparison of PI3K,p-Akt,eNOS,VEGF,MMP-2 protein expression in uterine tissue of rats in each group

3 討論

子宮異常出血是臨床常見、多發(fā)的疑難病癥，其中功能性子宮出血是子宮異常出血中最常見類型[11]。米非司酮聯合米索前列醇誘導早孕大鼠子宮出血是子宮出血動物模型最常見和穩(wěn)定的造模方法[12]。本研究用上述方法復制大鼠子宮出血模型，結果提示用米非司酮聯合米索前列醇復制大鼠子宮出血模型后，Model組大鼠陰道出血增多，凝血時間延長，激素水平紊亂并伴隨子宮內膜炎癥和微環(huán)境改變，與文獻[13-14]子宮出血模型指標變化一致，表明造模成功。

中醫(yī)藥在治療子宮出血方面有其獨特優(yōu)勢[15]，YZZXKL方中君藥炒地榆涼血瀉熱、收斂止血，旱蓮草入肝經血分而涼血止血，為治血熱出血之要藥，二者相伍，清熱涼血止血，直中病機。臣藥梔子清三焦之火而清熱涼血，側柏葉和槐花入血分清血熱，而涼血止血；蒲黃可活血、收斂、止血，為活血行滯之要藥，且對崩漏不止效果較好；四者炒制可入血分而清熱涼血、收斂止血，并能輔助君藥清熱涼血。佐藥：仙鶴草、拳參、大薊、陳棕炭為清熱止血佳品，且入血分而止血甚佳；丹皮與紅茜草可涼血、止血、活血之功，可防苦寒滯留、除瘀；生地養(yǎng)陰生津，涼血止血；白芍柔肝斂陰而治熱盛津傷；黃芩、貫眾苦寒，直折其火。當歸調經止血，為婦科之良藥，與白芍、生地共伍，可養(yǎng)血而除煩，與蒲黃、丹皮同用，可理氣行滯，和血止痛，且當歸性溫能散，味甘能緩，體潤能補，引諸藥以入沖任，共奏清熱涼血止血，調經止血之功。尹艷艷等[9]發(fā)現YZZXKL即婦科止血顆粒對早孕大鼠子宮出血具有較好的治療作用。本研究結果提示YZZXKL低、高劑量組大鼠陰道出血減少，凝血時間降低，激素水平升高，子宮內膜病變減輕且有新生血管生成，表明YZZXKL可提高子宮異常出血大鼠凝血功能、抑制子宮出血量，對異常出血子宮有一定的保護作用。然而其保護作用具體機制還不甚明確，本研究對此進行繼續(xù)探究，以期為YZZXKL走向國際化提供理論依據。

子宮異常出血機制復雜，近來研究發(fā)現子宮內膜血管生成障礙是造成子宮出血的主要原因之一[6]。岳明等[13]發(fā)現激素可使子宮局部微環(huán)境發(fā)生改變，促進子宮內膜上皮和血管再生，是徹底終止子宮出血的重要機制，其中血管生成受到VEGF等不同生長因子的調節(jié)。MMPs可參與新生血管、胚胎形成以及傷口愈合[16]，黃琪等[17]發(fā)現黃芩炭可通過升高VEGF和降低MMP-2、MMP-9表達，降低早孕大鼠子宮出血量。本研究結果表明Model組大鼠子宮出血可能與VEGF降低和MMP-2表達升高有關。Nasirzadehd等[18]發(fā)現PI3K-Akt-eNOS通路可參與血管生成。PI3K激活后可與Akt結合并促進Akt磷酸化，激活的AKT可轉移至細胞質和細胞膜，通過磷酸化作用激活eNOS促進其合成一氧化氮(nitricoxide,NO)，進而促進血管內皮細胞生成、增殖和防止血栓形成[19]。儲佳佳等[20]發(fā)現柚皮苷可通過激活PI3K-Akt-eNOS通路，減輕高糖誘導的血管內皮損傷。本研究結果提示Model組大鼠子宮組織PI3K-Akt-eNOS通路被抑制，YZZXKL降低大鼠子宮出血量的作用，可能是通過激活PI3K-Akt-eNOS通路蛋白表達，促進子宮組織血管生成來實現的。為了進一步驗證這一結論，本研究設置PI3K-Akt通路抑制劑LY研究，結果表明PI3K抑制劑可阻滯YZZXKL對PI3K/Akt通路的激活作用，減弱其對子宮出血大鼠的保護作用。進一步提示YZZXKL對異常出血的保護作用可能通過激活PI3K-Akt-eNOS通路實現。

4 結論與啟示

YZZXKL可提高子宮異常出血大鼠凝血功能和激素水平，改善出血情況，可能通過激活PI3K-Akt-eNOS通路，促進血管生成實現。為闡明YZZXKL治療子宮出血機制提供了一定參考價值。但PI3K-Akt-eNOS通路，促進血管生成抑制出血的機制十分復雜，且中藥治療疾病具有多靶點、多途徑的作用，YZZXKL還可能通過其他途徑抑制子宮出血，有待后續(xù)深入研究。