趙珈華，劉 洋，桂金秋，石學(xué)魁，唐小云

(牡丹江醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過建立數(shù)據(jù)分析庫，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)平臺分析數(shù)據(jù)庫提取信息以及采用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)，獲得藥物-靶點(diǎn)-疾病信息網(wǎng)絡(luò)，最終獲得藥物的藥理活性和毒性活性，以及對疾病的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從2007年首次明確概念[1]，發(fā)展至今已成為藥物分析的有力助手。2008年又將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)引入中藥的活性挖掘[2]，現(xiàn)已成功應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域研究。與傳統(tǒng)方法相比，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在探索中草藥活性成分作用機(jī)制方面更勝一籌[3]。

黃芪是豆科植物膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)或蒙古黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)的干燥根[4]。初載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)收錄于《中華人民共和國藥典》，性甘，微溫，入肺脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽、益氣養(yǎng)血之功能，為臨床常用補(bǔ)益藥用植物，多用于治療氣虛乏力、尿少水腫和癰膿瘡潰[5]。目前研究顯示黃芪含有黃酮、多糖、皂苷、氨基酸、微量元素等多種活性成分[4]，具有增強(qiáng)免疫力[6]、抗衰老[7]、輔助抗癌[8]、護(hù)肝[9]的作用等。黃芪應(yīng)用廣泛，被稱為中草藥中的“補(bǔ)藥之長”[10]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，分析黃芪免疫調(diào)節(jié)作用的活性成分及相應(yīng)作用靶點(diǎn)，探討其可能的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制，為進(jìn)一步的研究和應(yīng)用打下一定的基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 黃芪有效成分及靶點(diǎn)的篩選采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[11]輸入關(guān)鍵詞“黃芪”或“HuangQi”檢索黃芪的所有藥效化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度(OB≥30%)以及化合物類藥性(DL≥0.18)篩選黃芪的有效成分，并利用TCMSP 檢索獲得的活性成分，獲取其有效成分對應(yīng)靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)通過UniProt 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)注釋為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱，即為黃芪有效成分與作用靶點(diǎn)。

1.2 免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因靶點(diǎn)的篩選將“Immunoregulation”作為檢索詞輸入GeneCards 數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)檢索免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)基因靶點(diǎn)。

1.3 黃芪-免疫調(diào)節(jié)“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建選用R包(VennDiagram包)通過RStudio(版本1.4.1103)將免疫調(diào)節(jié)基因靶點(diǎn)與黃芪基因靶點(diǎn)取交集，得到Venn圖和交集靶點(diǎn)信息文本。將黃芪活性成分與其對應(yīng)靶點(diǎn)信息文本和免疫調(diào)節(jié)基因與黃芪基因交集靶點(diǎn)信息文本導(dǎo)入Cytoscape(版本3.7.2)構(gòu)建黃芪-免疫調(diào)節(jié)“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 黃芪-免疫調(diào)節(jié)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、核心基因篩選將黃芪有效成分的免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫平臺(http://string-db.org)，選擇“Multiple proteins”，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，其余參數(shù)保持默認(rèn)值設(shè)置，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction network，PPI)，將String平臺分析結(jié)果導(dǎo)出的string_interactions.tsv文件導(dǎo)入Cytoscape(版本3.7.2)篩選黃芪-免疫調(diào)節(jié)的核心基因。

1.5 黃芪-免疫調(diào)節(jié)基因富集分析將篩選出來的交集關(guān)鍵靶點(diǎn)基因通過RStudio(版本1.4.1103)選用R包(clusterProfiler包)進(jìn)行GO基因富集分析和KEGG 通路富集分析，并分別使用R語言命令繪制出兩種富集分析的柱狀圖和氣泡圖，以探討黃芪有效成分免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)蛋白在基因功能及信號通路中的作用。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用RStudio(版本1.4.1103)通過R包(Bioconductor包)對GO富集分析以及KEGG富集分析數(shù)據(jù)分別進(jìn)行處理，設(shè)置PvalueCutoff=0.05、QvalueCutoff=0.05為顯著性差異限定值。

2 結(jié)果

2.1 黃芪活性成分以及靶點(diǎn)篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，共得到化合物成分20個，對應(yīng)的靶點(diǎn)462個。應(yīng)用UniProt數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化注釋，最終得到活性成分17個，相應(yīng)靶點(diǎn)基因450 個,見表1。

表1 黃芪活性成分

2.2 免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因靶點(diǎn)的篩選通過Genecards網(wǎng)站選用“Immunoregulation”作為檢索詞，檢索到免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因569個，篩選其中RelevanceScore>1的免疫調(diào)節(jié)基因，最終篩選結(jié)果為267 個。

2.3 黃芪-免疫調(diào)節(jié)“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建應(yīng)用VennDiagram包對免疫調(diào)節(jié)基因靶點(diǎn)與黃芪有效成分基因靶點(diǎn)取交集，得到黃芪-免疫調(diào)節(jié)共同靶點(diǎn)42個(見圖1)。

圖1 免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)與黃芪有效成分作用靶點(diǎn)的Venn圖

應(yīng)用Cytoscape軟件(版本3.7.2)，將42個黃芪-免疫調(diào)節(jié)共同靶點(diǎn)構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)模型(見圖2)。結(jié)果顯示，黃芪的12種有效成分協(xié)同作用于42個免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，其中槲皮素(MOL000098)擁有最多的對應(yīng)靶點(diǎn)，達(dá)41個；山柰酚(MOL000422)、刺芒柄花素(MOL000392)、異鼠李素(MOL000354)、毛蕊異黃酮(MOL000417)分別含有15、4、3、2個靶點(diǎn)，說明槲皮素可能在免疫調(diào)節(jié)作用過程中起到關(guān)鍵作用，反映了黃芪免疫調(diào)節(jié)活性的多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖2 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 黃芪-免疫調(diào)節(jié)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、核心基因篩選在String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建42個共有靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)，共42個靶點(diǎn)和454條連線參與了PPI 網(wǎng)絡(luò)，454條連線代表了蛋白之間相互作用。將String數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果的string_interactions.tsv文件導(dǎo)入Cytoscape(版本3.7.2)，應(yīng)用軟件tools中的Network Analyzer對文件數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析(見圖4)。線條越粗代表combined-score越高，線顏色偏向橙紅色代表關(guān)聯(lián)度越強(qiáng)。節(jié)點(diǎn)越大代表combined-score越高，顏色越偏向橙紅色代表作用越強(qiáng)。應(yīng)用RStudio(版本1.4.1103)分析string_interactions.tsv，繪制黃芪免疫調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因-鄰接基因連線數(shù)目柱狀圖(見圖5)?；蚺c鄰接基因連線的數(shù)目越多，越可能為網(wǎng)絡(luò)調(diào)控核心基因，說明其在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大，很可能是黃芪藥效發(fā)揮的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 Cytoscape分析PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 黃芪-免疫調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因-鄰接基因連線數(shù)目柱狀圖

2.5 黃芪-免疫調(diào)節(jié)GO功能富集分析選用R語言的clusterProfiler 工具包[12]，將GeneSymbol 轉(zhuǎn)換為geneID，并對獲取的基因進(jìn)行GO 富集分析，以P<0.05 &Q<0.05進(jìn)行篩選，獲取74個GO 條目，對排名靠前的20個條目繪制柱狀圖(見圖6)和氣泡圖(見圖7)。結(jié)果顯示，免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、信號受體激活劑活性、生長因子受體結(jié)合、生長因子活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號通路、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合、趨化因子活性等方面。

圖6 GO功能富集分析柱狀圖

圖7 GO功能富集分析氣泡圖

2.6 黃芪-免疫調(diào)節(jié)KEGG通路富集分析選用R的clusterProfiler工具包[12]，將GeneSymbol轉(zhuǎn)換為geneID，并對獲取的基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P<0.05 & Q<0.05篩選出126條信號通路，排名前20的通路信息見表2，對前20個通路繪制柱狀圖(見圖8)和氣泡圖(見圖9)。結(jié)果顯示，黃芪免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)主要富集于糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、瘧疾(Malaria)、乙型肝炎(Hepatitis B)、查加斯病(Chagas disease)、甲型流感(Influenza A)、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、肺結(jié)核(Tuberculosis)、弓形蟲病(Toxoplasmosis)、人巨細(xì)胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)、丙型肝炎(Hepatitis C)等信號通路，提示黃芪有效成分可能通過多條信號通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

圖8 KEGG通路富集分析柱狀圖

圖9 KEGG通路富集分析氣泡圖

表2 KEGG通路富集分析潛在相關(guān)通路靶點(diǎn)

3 討論

中藥黃芪單獨(dú)應(yīng)用或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用具有免疫調(diào)節(jié)活性[13-14]，但是具體作用機(jī)制研究相對較少。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出17個黃芪的有效活性成分，預(yù)測了267個潛在相關(guān)免疫調(diào)節(jié)基因靶點(diǎn)。通過構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)黃芪免疫調(diào)節(jié)活性具有多靶點(diǎn)、多成分的特點(diǎn)。黃芪免疫調(diào)節(jié)的有效成分包括槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素、異鼠李素、毛蕊異黃酮、梔子醇、聯(lián)苯雙酯、黃芪異黃烷苷、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、黃芪紫檀烷苷、3,9-di-O-methylnissolin、7-O-methylisomucronulatol，其中大部分有效成分屬于黃酮類化合物，如槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素、異鼠李素、毛蕊異黃酮等；部分屬于烷基多糖苷類化合物，如黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷等。這12種化合物協(xié)同作用于42個免疫調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)基因，其中槲皮素可作用于41個靶點(diǎn)，山柰酚作用于15個靶點(diǎn)，異鼠李素作用于4個靶點(diǎn)，刺芒柄花素作用于3個靶點(diǎn)，其余成分僅作用于1～2個靶點(diǎn)。與在中國知網(wǎng)上檢索出的近幾年文獻(xiàn)幾乎相一致，黃芪的黃酮類化合物和烷基多糖苷類化合物具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[15-16]。表明黃芪能夠通過12個有效成分作用于多個靶點(diǎn)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果可以看出，TNF、IL-4、CXCL-8、IL-6、ICAM-1、AKT-1、TP53、VEGFA等因子與炎癥、趨化、黏附、凋亡等有關(guān)，可能是黃芪免疫調(diào)節(jié)的核心靶點(diǎn)。其中，TNF、IL-6是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，參與疾病發(fā)生發(fā)展過程中的免疫調(diào)節(jié)，SUN等[17]通過等研究發(fā)現(xiàn)獺兔在灌胃玉屏風(fēng)散后，其脾淋巴細(xì)胞促炎癥因子TNF和抗炎因子IL-4的mRNA表達(dá)均提高，同時發(fā)現(xiàn)血清中IL-4和TNF分泌增強(qiáng)。王潤田等[18]發(fā)現(xiàn)給外周血免疫細(xì)胞加入黃芪提取物可刺激細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6。IL-4對遲發(fā)型超敏反應(yīng)有著重要調(diào)節(jié)作用，朱艷平[19]應(yīng)用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)散可調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，使IL-4表達(dá)水平降低，從而緩解IV型超敏反應(yīng)。提示這些靶點(diǎn)是黃芪藥效成分發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位。為了研究黃芪有效成分免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)在基因功能和信號通路中的作用，本研究將42個免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。GO 分析結(jié)果顯示，黃芪有效成分主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、信號受體激活劑活性、生長因子受體結(jié)合、生長因子活性、參與凋亡信號通路的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合、趨化因子活性等方面；而KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)與黃芪免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)的通路有126條，主要包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、瘧疾通路、乙型肝炎通路、查加斯病通路、甲型流感通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路等。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪能夠作用于TNF信號通路靶點(diǎn)當(dāng)中的CASP-3、NFκB、IFN-γ、TNF、Akt、CASP-8、IL-6、ICAM-1，表明黃芪可調(diào)控TNF通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在TNF通路中，腫瘤壞死因子與特異性受體結(jié)合可以激活多條細(xì)胞通路，調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等。王潤田等[18]發(fā)現(xiàn)黃芪提取物可提高外周血淋巴細(xì)胞分泌TNF-α 的量，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的吞噬。這與本研究中KEGG通路富集分析在TNF 信號通路的結(jié)論是相吻合的。通過PPI網(wǎng)絡(luò)、GO、KEGG分析可以看出黃芪通過多靶點(diǎn)調(diào)控多通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討黃芪免疫調(diào)節(jié)作用的有效成分、相關(guān)靶點(diǎn)及相關(guān)信號通路，為進(jìn)一步研究黃芪免疫調(diào)節(jié)活性的作用機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，為黃芪的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。