劉逸夫，李建新，盧一寒，李靜，單忠艷，滕衛(wèi)平

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點實驗室，沈陽 110001；2.大連市第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，大連 116033）

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）是最常見的內(nèi)分泌疾病之一。甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）和甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TgAb）是最具有代表性的甲狀腺自身抗體［1-2］，妊娠婦女甲狀腺自身抗體陽性率可高達(dá)2%～17%［2］。在甲狀腺功能正常的AIT孕婦中，流產(chǎn)是最常見的不良妊娠結(jié)局，尤其是反復(fù)自然流產(chǎn)［3］。迄今，AIT孕婦流產(chǎn)風(fēng)險增加的原因尚不清楚［4］。

α-烯醇化酶（α-enolase，ENO1）存在于大多數(shù)真核生物體內(nèi)，廣泛分布于胎盤等不同組織中［5］。ENO1自身抗體（α-enolase antibody，ENO1Ab）在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種疾病及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中具有致病作用［6］。最新研究［7］表明，ENO1Ab可作為胎盤滋養(yǎng)層抗體參與母體不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生，并可作為該病的一種新的自身免疫標(biāo)志物。在不同疾病中，ENO1致病相關(guān)抗原表位肽不同。本研究擬探討ENO1分子中纖溶酶原結(jié)合部位的一種抗原表位肽（P9）特異自身抗體在AIT孕婦中的表達(dá)情況及其是否與甲狀腺功能正常的AIT孕婦流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本組研究對象來源于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌研究所主導(dǎo)的“妊娠早期及擬妊娠婦女碘鐵營養(yǎng)缺乏和亞臨床甲狀腺激素缺乏：篩查與干預(yù)”項目（簡稱SHEP項目）Ⅰ期。該項目由遼寧省沈陽市和大連市的23家醫(yī)院參與。從SHEP項目篩選在本地區(qū)居住5年以上，無遺傳疾病個人史和家族史，無嚴(yán)重慢性疾病史的妊娠＜8周孕婦，不排除服用碘劑或鐵劑（或含碘、鐵復(fù)合維生素）者，最終共篩選出9 415名孕婦。本研究為回顧性巢式病例對照分析，入組孕婦同時測定血清一種ENO1抗原表位肽（具有纖溶酶原結(jié)合功能）的特異自身抗體表達(dá)。本研究已獲得中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（AFSOP-07-1.0-01），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡21～43歲；（2）尿碘濃度（urinary iodine concentration，UIC）100～300 μg/L，即碘充足狀態(tài)［8］；（3）血清鐵蛋白（serum ferritin，SF）≥20 μg/L，即非鐵缺乏者［9］；（4）甲狀腺功能正常，血清游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）12.3～20.9 pmol/L［10］、血清促甲狀腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）0.10～4.34 mU/L［10］；（5）未服用任何影響甲狀腺功能的藥物。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有AIT以外的其他甲狀腺疾病及自身免疫病病史者；（2）患有高血壓、糖尿病、子癇以及其他與流產(chǎn)相關(guān)的疾病病史者；（3）本次妊娠存在前置胎盤、胎盤早剝及早產(chǎn)者；（4）有影響流產(chǎn)的用藥史者和有人工流產(chǎn)史者。

1.1.3 分組：（1）本次納入的孕婦均為甲狀腺功能正常者，根據(jù)其是否患有AIT，進(jìn)行分組。AIT組，血TPOAb≥34 IU/mL和（或）TgAb≥115 IU/mL［11］；非AIT組，血TPOAb＜34 IU/mL和TgAb＜115 IU/mL。（2）根據(jù)既往和本次妊娠隨訪監(jiān)測直至出現(xiàn)妊娠結(jié)局中是否發(fā)生過自然流產(chǎn)，再進(jìn)行分組。流產(chǎn)組，本次隨訪研究中發(fā)生了自然流產(chǎn)和（或）既往發(fā)生過自然流產(chǎn)；非流產(chǎn)組，本次隨訪中和既往均未發(fā)生過自然流產(chǎn)。

按納入及排除標(biāo)準(zhǔn)共納入2 109名孕婦，按上述分組方式獲得AIT流產(chǎn)組、非AIT流產(chǎn)組、AIT非流產(chǎn)組以及非AIT非流產(chǎn)組。同時，進(jìn)一步以AIT流產(chǎn)組樣本數(shù)為準(zhǔn)并按孕婦所在城市、受教育背景、家庭收入進(jìn)行1 ∶3匹配，確定AIT非流產(chǎn)組人數(shù)；以非AIT流產(chǎn)組為準(zhǔn)，同樣按照上述匹配方式確定非AIT非流產(chǎn)組人數(shù)。本研究最終共納入661名孕婦，其中，AIT流產(chǎn)組58例，AIT非流產(chǎn)組152例，非AIT流產(chǎn)組107例，非AIT非流產(chǎn)組344例。見圖1。

圖1 研究人群篩選標(biāo)準(zhǔn)方案圖Fig.1 Schematic diagram of study population screening criteria

1.2 方法

1.2.1 甲狀腺功能、甲狀腺自身抗體、SF、UIC和尿肌酐測定：血FT4、TSH、TPOAb、TgAb、SF和尿肌酐均采用電化學(xué)發(fā)光法（瑞士Roche公司）進(jìn)行測定。根據(jù)指南［11］推薦，本研究利用SHEP項目入組孕婦，參考美國臨床生化科學(xué)院推薦、在前期研究［10］中已建立的妊娠期特異參考范圍，也是本研究血FT4和TSH所采用參考范圍。同時，根據(jù)指南［11］，TPOAb和TgAb陽性的確定采用試劑盒所提供的普通成人參考范圍。UIC的測定采用基于Sandell-Kolthoff反應(yīng)的過硫酸銨消化砷鈰催化分光光度法［10］，計算UIC與尿肌酐比值（UIC/Cr）以及體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）=體質(zhì)量（kg）/身高2（m2）。

1.2.2 ENO1蛋白分子中參與纖溶酶原結(jié)合部位的一個抗原表位肽的預(yù)測及合成：利用IEDB網(wǎng)站和ABCpred網(wǎng)站對ENO1蛋白進(jìn)行抗原表位預(yù)測。IEDB網(wǎng)站預(yù)測人源ENO1蛋白中第252～270氨基酸序列為一個線型表位，亦是ENO1作為纖溶酶原結(jié)合蛋白的一個抗原表位；ABCpred網(wǎng)站也預(yù)測出人ENO1蛋白中第252～267氨基酸序列為一個線性表位，分值均為0.9。選取氨基酸序列253～267依次為N端-rsgkydld fkspddp-C端（因處于預(yù)測的全部ENO1蛋白線性抗原表位肽段中的第9段，簡稱P9）。將預(yù)測出的P9抗原表位肽委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并利用反相高效液相色譜法對合成肽段進(jìn)行純化，利用質(zhì)譜分析確定氨基酸序列。

1.2.3 ENO1分子中P9抗原表位特異自身抗體血清水平的測定：利用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA），按照本研究組已建立的ENO1Ab檢測方法進(jìn)行測定［12］。利用濃度為1 mg/mL的P9肽段進(jìn)行包被，4 ℃過夜；用1%BSA-PBS室溫封閉2 h，加入待測血清（1 ∶1 000稀釋），37 ℃孵育2 h；加入1 ∶5 000稀釋HRP結(jié)合羊抗人IgG二抗，37 ℃孵育1 h；加入TMB顯色，以O(shè)D450nm反映血清P9特異性總IgG表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，利用該軟件和1 ∶3傾向性評分匹配方法確定最終入組對象。對符合正態(tài)分布的連續(xù)變量，以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；對不符合正態(tài)分布的連續(xù)變量，以M（P25～P75）表示，采用Mann-WhitneyU秩和檢驗進(jìn)行組間比較。分類變量事件發(fā)生率以百分?jǐn)?shù)表示，并采用χ2檢驗比較。logistic回歸分析P9特異性自身抗體是否為自然流產(chǎn)的獨立危險因素。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并計算曲線下面積（area under curve，AUC），以判斷該抗體對流產(chǎn)的預(yù)測意義，并計算Youden指數(shù)以確定最佳切點值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對流產(chǎn)相關(guān)一般因素的比較分析

比較流產(chǎn)組與非流產(chǎn)組妊娠年齡、體質(zhì)量、BMI、心率、血壓、有飲酒史或吸煙史者比率、血TSH、FT4、TPOAb、TgAb和SF水平、UIC/尿Cr以及L-T4干預(yù)率，結(jié)果顯示，AIT流產(chǎn)組中L-T4干預(yù)率明顯低于AIT非流產(chǎn)組（P=0.003），而其他流產(chǎn)相關(guān)因素在2組間均無統(tǒng)計學(xué)差異。非AIT流產(chǎn)組的妊娠年齡、有飲酒史者的比率、血TSH和SF水平均明顯高于非AIT非流產(chǎn)組（P值分別為0.016，0.026，0.006，0.043），其他相關(guān)上述指標(biāo)在2組間均無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 流產(chǎn)相關(guān)一般因素分析Tab.1 Analysis of general factors associated with abortion

2.2 血清P9特異性自身抗體表達(dá)分析

ELISA結(jié)果顯示，AIT流產(chǎn)組孕早期血清P9特異性總IgG表達(dá)水平較AIT非流產(chǎn)組明顯升高（P＜0.001）；非AIT流產(chǎn)組亦明顯高于非AIT非流產(chǎn)組（P＜0.001）；AIT流產(chǎn)組較非AIT流產(chǎn)組有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 血清中抗ENO1蛋白分子中P9抗原表位肽特異自身抗體的表達(dá)水平分析Fig.2 Analysis of the expression level of P9 epitope peptide-specific autoantibodies in serum anti-ENO1 protein molecules

2.3 logistic回歸分析P9特異性自身抗體表達(dá)與流產(chǎn)的關(guān)系

分別在AIT和非AIT孕婦中行l(wèi)ogistic回歸分析P9特異性自身抗體表達(dá)與流產(chǎn)是否獨立相關(guān)。將AIT和非AIT人群中妊娠年齡與P9特異性自身抗體一同納入回歸分析中作為Model1（AIT：OR=7.13，95%CI：3.46～14.69，P＜0.05；非AIT：OR=2.67，95%CI：1.80～3.96，P＜0.05）；將公認(rèn)流產(chǎn)相關(guān)因素妊娠年齡、BMI及吸煙、飲酒與P9特異性自身抗體一同納入回歸分析中作為Model2（AIT：OR=6.31，95%CI：3.00～13.29，P＜0.05；非AIT：OR=2.81，95%CI：1.86～4.25，P＜0.05）；最后將上述流產(chǎn)公認(rèn)因素以及UIC/Cr、SF和TPOAb、TgAb、TSH及FT4與P9特異性自身抗體一同納入回歸分析中作為Model3（AIT：OR=8.42，95%CI：3.71～19.09，P＜0.05；非AIT：OR=2.92，95%CI：1.91～4.46），P＜0.05）。提示高滴度P9特異自身抗體的表達(dá)是導(dǎo)致甲狀腺功能正常AIT孕婦和非AIT孕婦流產(chǎn)發(fā)生的一個獨立危險因素。

2.4 ROC曲線分析P9特異性自身抗體的流產(chǎn)預(yù)測價值

AIT孕婦中P9特異性自身抗體預(yù)測流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險的AUC值 為0.75±0.04（P＜0.001，圖3），非AIT孕婦中的AUC值為0.66±0.03（P＜0.001）。說明該抗體的血清表達(dá)水平在甲狀腺功能正常的AIT孕婦中具有更好的流產(chǎn)預(yù)測價值。在AIT孕婦中該抗體血清水平預(yù)測自然流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險顯著增加的最佳切點值為OD450nm=1.21（Youden指數(shù)為0.431），在非AIT中為OD450nm=1.31（Youden指數(shù)為0.288）。在血清P9自身抗體檢測水平OD450nm＞1.21的AIT孕婦中，自然流產(chǎn)發(fā)生率為54.3%，而＜1.21者僅為15.3%，二者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。在該抗體血清水平＞1.31的非AIT孕婦中，流產(chǎn)發(fā)生率為43.5%，而≤1.31者則為16.7%，二者也有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。進(jìn)一步表明血清高滴度水平的P9特異性自身抗體與自然流產(chǎn)具有較強(qiáng)的相關(guān)性，尤其是在AIT孕婦中。

圖3 血清P9特異性自身抗體預(yù)測自發(fā)流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險的受試者工作特征曲線Fig.3 The receiver operating characteristic curve of serum P9-specific autoantibodies for predicting the risk of spontaneous abortion

3 討論

自然流產(chǎn)是妊娠期婦女常見的一種妊娠不良結(jié)局。研究［13］發(fā)現(xiàn)，甲狀腺自身免疫與母體流產(chǎn)密切相關(guān)，但其機(jī)制尚不清楚。英國倫敦瑪麗大學(xué)所做的系統(tǒng)回顧和薈萃分析顯示，應(yīng)用左旋甲狀腺素干預(yù)可使自然流產(chǎn)的發(fā)生率減少52%［14］。但SUN等［15］的meta分析結(jié)果顯示，給予甲狀腺功能正常的AIT妊娠婦女左甲狀腺素干預(yù)并未改善其妊娠不良結(jié)局。此外，甲狀腺自身抗體可能也是AIT孕婦發(fā)生不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險因素［16］。但研究［17］顯示，在患有AIT的婦女中，具有正常妊娠史者與具有復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)史者相比，血TPOAb和TgAb并無統(tǒng)計學(xué)差異，故認(rèn)為甲狀腺自身抗體陽性與反復(fù)性自然流產(chǎn)無關(guān)。綜上推測可能存在甲狀腺功能減退和經(jīng)典甲狀腺自身抗體以外的因素促使AIT孕婦流產(chǎn)的發(fā)生率升高。

AIT雖然曾被認(rèn)為是一種器官特異性自身免疫性疾病，但其患者體內(nèi)存在某些非甲狀腺特異自身抗體。研究［18］顯示，甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）免疫可產(chǎn)生TgAb的同時，還可促使TPOAb等其他自身抗體的生成，這是由于Tg分子中B細(xì)胞抗原表位的擴(kuò)散導(dǎo)致，而抗原擴(kuò)散被認(rèn)為是促進(jìn)自身免疫病進(jìn)展的一種機(jī)制［19］。本課題組前期動物實驗研究結(jié)果也顯示，給予小鼠Tg免疫不僅可引起其體內(nèi)TgAb升高，也可促使ENO1Ab的產(chǎn)生增加。同樣，給予小鼠ENO1重組蛋白免疫也可使機(jī)體產(chǎn)生ENO1Ab增加，并引起小鼠血清TgAb升高［12］。提示ENO1蛋白可能也是AIT致病機(jī)制中一個重要的自身抗原，盡管它并非甲狀腺特異表達(dá)的蛋白。

ENO1已被發(fā)現(xiàn)在多種組織（如大腦、甲狀腺、血管內(nèi)皮、卵巢、胎盤等）中表達(dá)。最近的研究證實，在胎盤這個富含血管的組織部位確有較多量ENO1表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)可能與胎膜滯留有關(guān)。最新研究［7］發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胎盤蛻膜中ENO1蛋白表達(dá)量明顯升高，認(rèn)為血清抗ENO1Ab水平可作為不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的一種新的自身免疫生物標(biāo)志物。除此之外，ENO1作為纖溶酶原結(jié)合蛋白可與纖溶酶原結(jié)合，促進(jìn)其被激活成為纖溶酶，進(jìn)而增強(qiáng)纖溶系統(tǒng)活性。在許多系統(tǒng)性自身免疫性疾病中，纖溶酶原結(jié)合蛋白抗原表位抗體的表達(dá)升高，后者可阻斷纖溶酶原向纖溶酶轉(zhuǎn)換，干擾體內(nèi)纖溶系統(tǒng)，從而破壞纖維蛋白形成與溶解之間的動態(tài)平衡，可導(dǎo)致血栓前狀態(tài)，并與自然流產(chǎn)密切相關(guān)［20］。AIT常與系統(tǒng)性自身免疫病伴發(fā)［21］，故AIT妊娠婦女發(fā)生自然流產(chǎn)的機(jī)制很可能與自身免疫性疾病中誘發(fā)母體流產(chǎn)的機(jī)制存在相似之處。

韓冬等［22］利用噬菌體庫展示技術(shù)結(jié)合Ellipro、PDB等生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)人ENO1第257～268氨基酸可能是引起機(jī)體免疫應(yīng)答的活性表位肽，此肽段特有的空間結(jié)構(gòu)均有利于與抗體特異性結(jié)合。本研究的P9肽段完整包含了該肽段，且還是人ENO1蛋白發(fā)揮纖溶酶原結(jié)合作用的特殊肽段［23］。以上均提示P9肽段自身抗體可能通過干擾ENO1蛋白與纖溶酶原的結(jié)合而干擾纖溶系統(tǒng)的作用，導(dǎo)致流產(chǎn)風(fēng)險的增加。本研究發(fā)現(xiàn)，AIT流產(chǎn)組血清抗P9自身抗體的表達(dá)水平明顯高于AIT非流產(chǎn)組；非AIT流產(chǎn)組該抗體的表達(dá)水平亦明顯高于非AIT非流產(chǎn)組。在AIT和非AIT婦女中，抗P9自身抗體均是引起自然流產(chǎn)的獨立危險因素，但在AIT孕婦中具有更高預(yù)測流產(chǎn)風(fēng)險的價值。血清中該抗體滴度水平檢測對預(yù)測婦女（尤其是AIT孕婦）自然流產(chǎn)的風(fēng)險具有一定臨床意義。有必要對該抗體引起自然流產(chǎn)的作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究。同時，本課題組的前期研究［24］已發(fā)現(xiàn)，ENO1全蛋白特異總IgG在AIT患者血清中表達(dá)水平顯著高于非AIT患者，提示ENO1蛋白分子中其他一些抗原決定簇特異的自身抗體可能也是促進(jìn)AIT婦女流產(chǎn)風(fēng)險增加的重要因素。