周 婷，盧方云，黃 瑾，吳瑀婕，吳海虹，張新笑，徐為民，鄒 燁,，王道營,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇南京 210014）

膠原蛋白（Collagen）是一種幾乎存在于所有動物體內(nèi)的生物高分子聚合物，約占動物體內(nèi)總蛋白的30%[1]。膠原蛋白肽是膠原蛋白的降解產(chǎn)物，是通過酸、堿和蛋白酶等水解得到的一系列短肽，相對分子質(zhì)量分布范圍在幾百至幾千道爾頓。目前，傳統(tǒng)的膠原蛋白肽原料來源仍集中于牛骨、牛皮和豬皮等，但近年來瘋牛病、口蹄疫、豬瘟等疾病的持續(xù)爆發(fā)和極高的傳染性[2]，人們對這些類膠原蛋白肽產(chǎn)品的安全性表示懷疑；另外由于宗教信仰和社會問題，來自牲畜的膠原蛋白肽產(chǎn)品在部分地區(qū)受到抵制。我國家禽業(yè)規(guī)模龐大，目前是世界上家禽第二生產(chǎn)國，2019 年的雞肉產(chǎn)量高達1830 萬噸，僅次于美國[3]。雞爪是富含Ⅰ型膠原蛋白的產(chǎn)品，此膠原蛋白受熱易溶出，所以其具有很高的營養(yǎng)價值和極佳的口感。當(dāng)前國內(nèi)外研究偏向于水產(chǎn)和海產(chǎn)膠原蛋白肽，對于從家禽中提取膠原蛋白肽的有關(guān)研究和報道偏少。

膠原蛋白肽具備許多優(yōu)異的功能特性，如保水性、溶解性、乳化性、起泡性和抗氧化性等[4]。目前工業(yè)上通常采用化學(xué)方法（酸堿法）提取膠原蛋白肽，采用酸液或堿液的作用斷開肽鍵的化學(xué)類方法，反應(yīng)過程較為劇烈，得到的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可能會被嚴(yán)重?fù)p壞。酶法相較于常規(guī)的化學(xué)方法，因其周期短、污染小、溫和安全更占據(jù)優(yōu)勢；超聲波設(shè)備操作簡單，應(yīng)用范圍廣且效率高效。由于酶解技術(shù)也存在一定的缺陷，所以動物膠原的提取一般采用復(fù)合法，通過一些輔助技術(shù)與酶法結(jié)合，此研究將超聲波技術(shù)作為輔助技術(shù)，輔助酶處理可使細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，利于溶劑滲透到細(xì)胞中，縮短膠原蛋白肽提取時間，提高膠原蛋白肽得率。故本研究擬以無骨雞爪為原料，考察料液比、酶解時間、超聲功率對無骨雞爪膠原蛋白肽得率的影響，旨在提高膠原蛋白肽的產(chǎn)率，并對其理化性質(zhì)進行研究，有望為生產(chǎn)膠原蛋白肽提供一種新的途徑，同時為畜禽類副產(chǎn)物的利用開辟新的途徑，提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單凍雞爪 山東榮華食品集團有限公司，冰凍狀態(tài)保存于實驗室冷凍柜中，用蒸餾水清洗一下，低溫通風(fēng)晾干后分裝好在?20 ℃保存?zhèn)溆茫晃傅鞍酌福ㄘi胃粘膜）（USP 級，1:30000）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、胰蛋白酶（1:4000）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 U/mg） 源葉生物公司；氫氧化鈉、無水碳酸鈉和鹽酸 國產(chǎn)分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；羥脯氨酸（Hyp）測試盒（消化法）和羥脯氨酸試劑標(biāo)準(zhǔn)品 南京建成生物工程研究所。

PTX-FA210S 電子天平 福州華志科學(xué)儀器；HTP-312 電子天平 上?；ǔ睂崢I(yè)有限公司；國華78-1 磁力加熱攪拌器、HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；SCIENTZ-IID 超聲波細(xì)胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S 數(shù)顯集熱式磁力攪拌器 上海易友儀器有限公司；FiveEasy Plus pH 計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Eppendorf 離心機 德國艾本德股份公司；TG16-WS 臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；XW-80A 微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司；Gen5 全波長酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；Direct-Q3uv 超純水機 美國Millipore 公司；Alpha1-2LDplus 實驗室型凍干機德國Christ 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無骨雞爪膠原蛋白肽的酶解工藝流程 無骨雞爪的制備→脫脂和除雜→水洗→超聲波輔助酶解→滅酶→離心→膠原蛋白肽提取液→凍干成粉末

1.2.2 工藝操作要點

1.2.2.1 雞爪剔骨 將冷凍雞爪進行流水解凍，用70～80 ℃的水浸泡3～6 min。把雞爪依次撈出掌心朝上置于砧板，首先用刀在雞爪跗跖骨末端和關(guān)節(jié)處橫切，然后沿著跗跖骨豎切一刀，此時順著刀口可取出跗跖骨；再用剪刀除去趾骨，在每根趾上豎切，依次取出趾骨，剩余部分則稱為無骨雞爪。然后將所得的無骨雞爪分裝于自封袋中，于?20 ℃中保藏備用。

1.2.2.2 無骨雞爪脫脂 將一定量的皮塊組織顆粒裝入燒杯中，首先向其中加入5 倍蒸餾水（以皮塊質(zhì)量為基準(zhǔn)），而后加入0.5%的NaOH 和0.5%的Na2CO3（以蒸餾水的質(zhì)量為基準(zhǔn)），混合均勻后在40 ℃攪拌1 h，后取出樣品冷卻淋干，再加入0.5%的Na2CO3（以蒸餾水的質(zhì)量為基準(zhǔn)），繼續(xù)攪拌1 h，待冷卻淋干后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 無骨雞爪除雜 無骨雞爪在0.1 mol/L的NaOH溶液（液料比10:1 mL/g）中浸6 h，溶液每3 h 更換一次，堿處理后的樣品要用去離子水沖洗至中性。以除去其中多余雜質(zhì)和非膠原成分。

1.2.2.4 真空冷凍干燥 將制得的無骨雞爪膠原蛋白肽提取液倒入玻璃平皿中，在?18 ℃冰箱中冷凍24 h，放入凍干機中真空冷凍干燥48 h，得到無骨雞爪膠原蛋白肽粉末，放置于干燥器中備用。

1.2.3 無骨雞爪成分的測定 水分含量測定參照GB5009.3-2016 直接干燥法[5]；灰分含量測定參照GB5009.4-2016 高溫灼燒法[6]；脂肪含量測定參照GB5009.6-2016 索氏抽提法[7]；蛋白質(zhì)含量測定參照GB5009.5-2016 凱式定氮法[8]。

1.2.4 羥脯氨酸含量的測定及膠原蛋白肽得率的計算 膠原蛋白肽被含有一定量氯化亞錫的鹽酸溶液水解釋放出羥脯氨酸，經(jīng)過氧化劑氯胺T 氧化后，在一定溫度條件下可與對二甲氨基苯甲醛溶液反映生成紅色絡(luò)合物，在550 nm 波長處具有最大吸收峰，因此，可用紫外分光光度法進行定量測定[9]。以下公式（1）和（2）分別是膠原蛋白肽含量和膠原蛋白肽得率。

式中：A 為羥脯氨酸含量（μg/mL）；B 為酶解過程提取液的體積（mL）；7.7 為無骨雞爪膠原蛋白肽含量與羥脯氨酸含量換算系數(shù)；C 為無骨雞爪樣品干重（g）；C1為無骨雞爪膠原蛋白肽提取液的凍干量（g）。

1.2.5 酶的選擇 不同蛋白酶因其專一性具有不同的酶切位點[10]，本次試驗分別采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶對無骨雞爪進行酶解，篩選出一種適用于提取無骨雞爪中膠原蛋白肽的酶。取用一定量的無骨雞爪進行預(yù)處理，測定其中膠原蛋白肽的含量。經(jīng)過預(yù)處理的無骨雞爪平均分成5 份，每份濕重約為10 g（干重為3.534 g），控制料液比為1:15，超聲時間為30 min，超聲功率為200 W，提取的pH 分別為7.5（木瓜蛋白酶）、2.0（胃蛋白酶）、9.0（堿性蛋白酶）、7.0（復(fù)合蛋白酶）和7.8～8.5（胰蛋白酶），酶解溫度除了復(fù)合蛋白酶在55 ℃下提取，其它蛋白酶均在45 ℃下進行提取，酶解時間均為4.0 h，加酶量均為6000 U/g。

1.2.6 超聲輔助酶法提取的單因素實驗 將經(jīng)過預(yù)處理（脫脂和除雜）后的無骨雞爪稱取濕重5 g（干重為1.767 g）左右，進行超聲波（工作時間2 s、停止時間3 s）輔助提取，最終以膠原蛋白肽得率為指標(biāo)，分別研究料液比、超聲功率、超聲時間和酶解時間四個因素條件的選擇。

1.2.6.1 料液比對膠原蛋白肽得率的影響 往經(jīng)過處理的無骨雞爪中加入蒸餾水，固定料液比為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL，對其進行超聲功率200 W，超聲時間30 min 作用后，分別向其中加入0.0525 g的堿性蛋白酶（加酶量為6000 U/g），調(diào)節(jié)pH 使其穩(wěn)定于9.0。而后放入45 ℃恒溫水浴鍋中酶解4 h，最后在100 ℃中滅酶10 min，取出冷卻，在10000 r/min 離心10 min，取上清液測定其中羥脯氨酸含量，并將所得上清液凍干成膠原蛋白肽粉。

1.2.6.2 超聲功率對膠原蛋白肽得率的影響 稱取經(jīng)過處理的無骨雞爪5 g 左右，以1：15 g/mL的比例加入蒸餾水，對其分別進行超聲功率100、150、200、250、300 W 作用，其余步驟同1.2.6.1。

1.2.6.3 超聲時間對膠原蛋白肽得率的影響 稱取經(jīng)過處理的無骨雞爪5 g 左右，以1:15 g/mL的比例加入蒸餾水，進行超聲功率為200 W，超聲時間分別為20、25、30、35、40 min 作用后，其余步驟同1.2.6.1。

1.2.6.4 酶解時間對膠原蛋白肽得率的影響 稱取經(jīng)過處理的無骨雞爪5 g 左右，以1：15 g/mL的比例加入蒸餾水，進行超聲功率為200 W，超聲時間為30 min 作用后，向其中加入0.0525 g的堿性蛋白酶（加酶量為6000 U/g），調(diào)節(jié)pH 使其穩(wěn)定于9.0，放入45 ℃恒溫水浴鍋中分別酶解3.5、4、4.5、5 h，其余步驟同1.2.6.1。

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 以單因素實驗得到的結(jié)果為基礎(chǔ)，以料液比、超聲功率和酶解時間為響應(yīng)因子，進行三因素三水平的Box-Behnken 試驗，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因素，以膠原蛋白肽得率為響應(yīng)值，分析優(yōu)化的最佳提取條件，每一自變量的低、中、高實驗水平分別以?1、0、1 進行編碼，試驗的各因素水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平設(shè)計Table 1 Factor level of Box-behnken test

1.2.8 無骨雞爪膠原蛋白肽在不同pH 下的溶解度測定 為了驗證經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化提取的無骨雞爪的膠原蛋白肽的溶解性能，準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確到0.001 g）響應(yīng)面優(yōu)化條件下制得的無骨雞爪膠原蛋白肽樣品（即在酶解時間為4 h 條件下得到的產(chǎn)物），加入50 mL的蒸餾水，用0.1 mol/L HCl 溶液或0.1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，等pH 穩(wěn)定后常溫下用磁力攪拌器均勻攪拌肽液30 min，然后用離心機5000 r/min 離心15 min，吸取上清液并用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量[11]。計算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果采用Excel 2016、Origin 9.0、Design-Expert 8.0.6 對數(shù)據(jù)進行整理分析和作圖。數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 18.0，運用單因素ANOVA-圖基法對數(shù)據(jù)進行單因素檢驗分析，P<0.05 表示兩組數(shù)據(jù)間具有顯著性差異。Design-Expert 8.0.6 軟件用于響應(yīng)面分析，得出最優(yōu)提取值。

2 結(jié)果與分析

2.1 無骨雞爪的基礎(chǔ)成分

無骨雞爪的基礎(chǔ)成分如表2 所示，無骨雞爪蛋白質(zhì)含量為48.68%，脂肪含量為19.87%，其蛋白質(zhì)含量高脂肪含量低，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。根據(jù)以往相關(guān)文獻[12]可得，豬肉中蛋白質(zhì)含量約為10.88%～15.76%，雞肉中蛋白質(zhì)含量約為16.24%～19.42%，兔皮中蛋白質(zhì)含量約為20.68%～28.43%，由此可見，無骨雞爪中粗蛋白含量相對較高，有利于后期膠原蛋白肽的提取與優(yōu)化。

2.2 酶的選擇

試驗結(jié)果以膠原蛋白肽得率作為指標(biāo)，因此，通過測定酶解液中膠原蛋白肽含量即可選出適宜的酶進行接下來的實驗。

從圖1 可得出，以酶解所得膠原蛋白肽得率為指標(biāo)，五種酶提取無骨雞爪膠原蛋白肽的能力高低順序為：堿性蛋白酶>胰蛋白酶>復(fù)合蛋白酶>胃蛋白酶>木瓜蛋白酶，即堿性蛋白酶作用最為顯著（P<0.05），因此選用堿性蛋白酶提取無骨雞爪膠原蛋白肽。堿性蛋白酶具有催化水解肽鍵的能力[13]，與反應(yīng)物結(jié)合，破壞無骨雞爪中大分子物質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，最終使二級結(jié)構(gòu)分解為分子量更小的肽鏈或氨基酸[14]。

圖1 酶的種類與無骨雞爪膠原蛋白肽得率的關(guān)系Fig.1 Relationship between enzyme types and collagen peptide yield of boneless chicken feet

2.3 單因素實驗結(jié)果

2.3.1 料液比對膠原蛋白肽得率的影響 適宜的料液比對膠原蛋白肽的提取至關(guān)重要，可直接影響酶與底物的接觸面積和接觸程度[15]。由圖2 可知，無骨雞爪膠原蛋白肽得率在料液比1:5～1:25 g/mL 之間整體呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)料液比達到1:25 g/mL 時，其得率達到最大，而后隨著料液比增加，得率開始呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。隨著料液比的增加，膠原蛋白肽得率增加是因為酶與底物充分結(jié)合使得反應(yīng)完全[16]；由于加入酶和皮塊的質(zhì)量是一定的，不同的液料比會影響其濃度，因而影響其酶解的速率，當(dāng)液料比達到1:25 g/mL 時，無骨雞爪組織變成足夠疏松狀態(tài)，此時繼續(xù)增大料液比，對于整個反應(yīng)體系來說，酶的濃度降低，其與底物不能達到最佳作用點[17?18]，膠原蛋白肽得率不會繼續(xù)增加，因此，最佳料液比選定為1:25 g/mL。

圖2 料液比對膠原蛋白肽得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on the yield of collagen peptide yield

2.3.2 超聲功率對膠原蛋白肽得率的影響 超聲波技術(shù)具有時間短，效率高的特點[19]，有研究表明，經(jīng)超聲輔助制得的膠原蛋白肽得率與傳統(tǒng)酶法相比提高了25%[20]。如圖3 所示，無骨雞爪膠原蛋白肽得率在超聲功率為100～250 W 之間逐漸增加，當(dāng)超聲功率為250 W 時，膠原蛋白肽得率達到一個峰值，后隨著超聲功率的增加，其得率開始下降。由于適當(dāng)?shù)某暪β仕a(chǎn)生的超聲波可加快水的振動，使傳質(zhì)強化，同時增大樣品組織間隙和加大細(xì)胞的破碎程度，促進后續(xù)酶的進入，有利于酶解反應(yīng)的進行。在超聲強度較低時，超聲波強度越大所產(chǎn)生的空化效應(yīng)越明顯，但當(dāng)超聲強度增加到一定程度后出現(xiàn)過飽和現(xiàn)象，形成音障，阻礙超聲波的傳遞，從而使超聲作用減弱[21]。因此，最佳超聲功率選定為250 W。

圖3 超聲功率對膠原蛋白肽得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on collagen peptide yield

2.3.3 超聲時間對膠原蛋白肽得率的影響 隨著超聲時間的增長，產(chǎn)生的空化效應(yīng)更加強烈，局部產(chǎn)生的高溫高壓有利于后期實驗酶的融入，加快膠原蛋白肽的提取[22]。圖4 結(jié)果顯示，無骨雞爪中膠原蛋白肽得率隨著超聲時間的增加變化顯著，超聲時間為25 min 時，膠原蛋白肽得率最大。隨著超聲時間的增加，超聲體系的溫度逐漸升高，有可能會破壞樣品組織結(jié)構(gòu)，使樣品中膠原蛋白發(fā)生部分水解。超聲時間在20～25 min 之間，無骨雞爪中膠原蛋白肽得率增加，這是因為超聲波在細(xì)胞內(nèi)引起渦流擴散，加大細(xì)胞內(nèi)外有效成分的濃度差，加速細(xì)胞溶質(zhì)傳質(zhì)速率[23]，無骨雞爪中大量膠原蛋白迅速溶出。但超聲提取時間過長，超聲熱效應(yīng)更明顯，一些膠原變性，使得溶解度逐漸降低，致膠原蛋白肽得率開始下降。因此，選擇超聲時間25 min 為最佳值。這與張曉潔等[24]的研究結(jié)果的變化趨勢相符。

圖4 超聲時間對膠原蛋白肽得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on collagen peptide yield

2.3.4 酶解時間對膠原蛋白肽得率的影響 酶[25]作為一種生物催化劑，對底物的催化能力存在一定的飽和度，酶解時間反映酶與底物的接觸時間，影響膠原蛋白肽最終得率，有研究表明[26]不同酶對相同底物和相同酶對不同底物的酶解時間均是不同的。在前期預(yù)實驗中，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶對無骨雞爪酶解效果最佳，堿性蛋白酶的最佳pH 為9.0，因此選擇pH9.0；關(guān)于加酶量，在前期預(yù)試驗時對比過加酶量和酶解時間對膠原蛋白肽得率的影響，結(jié)果顯示酶解時間對得率的影響更顯著，因此選擇酶解時間進行后續(xù)工藝優(yōu)化。由圖5 可知，無骨雞爪中膠原蛋白肽得率在酶解時間在3.5～4.0 h 內(nèi)為遞增趨勢，隨著酶解時間的增加，底物與酶充分接觸，這有利于膠原蛋白肽的提取。當(dāng)酶解時間為4.0 h 時，其得率達到最大值，而后隨著酶解時間的增加，其得率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，這是由于當(dāng)酶量一定時，酶提時間越長，部分膠原蛋白肽發(fā)生水解。當(dāng)酶解時間<4.0 h 時，由于酶反應(yīng)不完全，膠液濃度太稀，得率隨反應(yīng)時間增加而增加；當(dāng)酶解時間>4.0 h 時，酶反應(yīng)過度，部分膠原蛋白肽開始繼續(xù)水解，使膠原蛋白肽的產(chǎn)品質(zhì)量下降，得率隨之降低。因此，最佳酶解時間為4.0 h。

圖5 酶解時間對膠原蛋白肽得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic extraction time on collagen peptide yield

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.4.1 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗 通過 Design-Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)處理軟件對表3 結(jié)果進行回歸擬合，得到A（料液比）、B（超聲功率）、C（酶解時間）3 個因素與R1（膠原蛋白肽得率）之間的回歸方程，多元二次回歸模型方程（1）為R1=49.53+3.35A?0.64B?1.90C+2.43AB+2.22AC?0.27BC?7.33A2?6.10B2?2.20C2。由回歸方程可知，方程（1）中A的系數(shù)最大，其次是C，最小的是B，這就表明A（料液比）對無骨雞爪中膠原蛋白肽得率的影響作用最大。

表3 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

由表4 可看出，模型的F=40.56>F0.01（14，4）=14.4，P<0.0001，表明本實驗的模型是高度顯著的，不同處理間的差異極顯著；失擬項P>0.05，說明模型失擬度不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.9570，實驗值與預(yù)測值非常接近，其線性關(guān)系和二次關(guān)系是極顯著的（P<0.0001），說明該模型可很好的解釋響應(yīng)值。模型的調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9547，說明該模型能解釋95.47%響應(yīng)值的變化，因而擬合程度較好，實驗誤差小，可用此模型對超聲波輔助酶法提取無骨雞爪中膠原蛋白肽進行分析和預(yù)測。對模型進行方差分析，結(jié)果見表4，一次項A 和C（P<0.05）顯著，一次項B（P>0.05）不顯著；交互項AB（P<0.05）顯著，BC 和AC（P>0.05）不顯著；二次項A2和B2（P<0.0001）極顯著，C2（P<0.05）顯著。這就表明料液比和酶解時間這兩個因素對無骨雞爪膠原蛋白肽得率具有顯著的影響，料液比和超聲功率的交互作用也對無骨雞爪膠原蛋白肽得率具有顯著的影響。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Regression model analysis of variance

2.4.2 響應(yīng)面分析 超聲功率、酶解時間、料液比的交互作用對響應(yīng)值的影響分析如圖6～圖8 所示。通過響應(yīng)曲面陡峭程度和三維等高線的形狀，可以直觀地判斷兩因素間交互作用程度。對比圖6～圖8 響應(yīng)面的陡峭程度和等高線的形狀可見，圖6 整個坡面較陡，等高線呈現(xiàn)橢圓的形狀，說明料液比和超聲功率的交互作用對膠原蛋白肽得率影響較大。圖7 和圖8的響應(yīng)面值坡面均較緩，等高線形狀趨于圓形，可得出料液比和酶解時間的交互作用、超聲功率和酶解時間的交互作用對膠原蛋白肽得率的影響均不大，這與方差分析的結(jié)果一致。所有的響應(yīng)曲面圖均開口朝下，這也就說明試驗結(jié)果有最大值存在。

圖6 料液比和超聲功率對無骨雞爪中膠原蛋白肽得率的影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the effects of solid-liquid ratio and ultrasonic power on collagen peptide yield in boneless chicken feet

圖7 料液比和酶解時間對無骨雞爪中膠原蛋白肽得率的影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of the effects of feed-liquid ratio and enzymatic extraction time on collagen peptide yield in boneless chicken feet

圖8 超聲功率和酶解時間對無骨雞爪中膠原蛋白肽得率的影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of the effects of ultrasonic power and extraction time were used to obtain collagen peptide from boneless chicken feet

2.4.3 無骨雞爪膠原蛋白肽提取工藝參數(shù)的優(yōu)化和模型驗證 通過響應(yīng)面法得到無骨雞爪膠原蛋白肽的最優(yōu)提取工藝為：超聲波功率為249.50 W、酶解時間為3.83 h、料液比為1:25.87 g/mL，預(yù)期膠原蛋白肽得率為50.15%?？紤]到實際工藝條件，將參數(shù)調(diào)整為：超聲波功率250 W、酶解時間為4 h、料液比 1:26 g/mL。為了進一步驗證模型的可靠性，在此條件下進行三次平行試驗，膠原蛋白肽得率為49.24%±0.98%，與理論值較為接近，說明該響應(yīng)面模型可用于優(yōu)化無骨雞爪膠原蛋白肽的提取。

2.5 pH 對無骨雞爪膠原蛋白肽溶解度的影響

膠原蛋白肽溶解度是通過氮溶解指數(shù)來表示的，氮溶解指數(shù)（NSI）[27]是指在控制浸出條件下，蛋白質(zhì)溶解在水中的氮占總氮的百分比，它是一個反映蛋白質(zhì)水溶性大小的物理量。膠原蛋白是極其典型的兩性聚電解質(zhì)，pH 低于或高于等電點時，膠原蛋白將帶一定電荷，即呈正離子或負(fù)離子狀態(tài)，電荷互相排斥，分子分散性好，導(dǎo)致溶解度增高。溶液pH 偏離等電點越遠(yuǎn)，膠原蛋白所帶凈電荷越高，溶解度相應(yīng)越高。在等電點時[28]，膠原蛋白主要以兩性離子狀態(tài)存在，溶解度最低。在不同pH 下的溶解度差異很大，如果單一選定一個pH 值，則測得的值不準(zhǔn)確，且不具備參考意義。圖9 反映的是無骨雞爪膠原蛋白肽在不同pH 下的溶解度，可得在pH 為4.0 時，溶解度最?。籶H 為7.0 時，溶解度最大。膠原蛋白肽屬于兩性電解質(zhì)，其溶解度大小和等電點密不可分[29]，在等電點附近，膠原蛋白肽所帶的靜電荷幾乎為零，分子間由于不存在靜電斥力的作用，易于聚集沉降，因而溶解度較??；當(dāng)所處pH 偏離等電點時，膠原蛋白肽帶有一定量的靜電荷，分子間存在靜電斥力，傾向于分散，因而溶解度較大。無骨雞爪膠原蛋白肽在pH4.0～5.0 之間有等電點，所以在pH 為4.0 時，其溶解度最小。隨著酶解時間的增加，溶解度也在增長，這是由于經(jīng)堿性蛋白酶水解后，大分子的蛋白質(zhì)解鏈，變成多肽、短肽等，親水性增加，從而溶解度增加[29]。

圖9 pH 對無骨雞爪膠原蛋白肽溶解度的影響Fig.9 Effect of pH on solubility of collagen peptide boneless chicken feet

3 結(jié)論

以膠原蛋白肽得率為考察對象，通過單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，對無骨雞爪膠原蛋白肽的提取工藝進行了優(yōu)化，得到最佳提取工藝為：料液比為1:26 g/mL、超聲波功率為250 W 和酶解時間為4 h。而影響無骨雞爪膠原蛋白肽得率的三個因素影響程度大小順序為料液比>酶解時間>超聲功率，超聲波輔助提取無骨雞爪膠原蛋白肽得率可達49.24%±0.98%（占除雜后雞爪干質(zhì)量），符合響應(yīng)面模型驗證結(jié)果。

超聲輔助堿性蛋白酶提取的無骨雞爪膠原蛋白肽的溶解度在酶解時間4 h 時，可達到90%以上。經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化提取得到的無骨雞爪高溶解度膠原蛋白肽可提高雞爪的綜合利用程度，提升雞爪的潛在價值，為雞爪的精深加工提供科學(xué)依據(jù)。