劉 迪，叢艷君

（北京工商大學食品與健康學院，北京市食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048）

母乳是嬰兒的最佳食物[1]。當母乳不足時，通常會使用以牛乳為基料的嬰兒配方粉作為替代品[2]。但是這種替代品可能導致一些嬰幼兒發(fā)生過敏反應，即牛乳蛋白過敏（cow milk protein allergy，CMPA）[3]。

CMPA 是一種復雜的疾病，是由IgE 和非IgE介導的過敏反應。過敏原和抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APCs）在啟動特異性免疫反應中起著重要作用（如圖1）。在APCs的刺激下，前體細胞Th0（T 輔助）可以分化為兩種類型：分化為Th1 細胞的途徑受白細胞介素（interleukin，IL）-12的誘導，Th1 細胞產(chǎn)生的特征細胞因子包括IL82、IL-15 和干擾素γ（interferon gamma，IFNγ）；分化為Th2 細胞的途徑受到IL-4的誘導，釋放的特征細胞因子包括IL-5、IL-10 和IL-13。最重要的是，Th1 和Th2 反應是相互抑制的。例如，IL-4 和IL-10 抑制Th1 反應，而IL-12 和IFNγ抑制Th2 反應。這種交叉抑制反應通常會導致一種混合表型，但可能在個體中偏向于一種途徑，這取決于遺傳背景、抗原暴露水平和致病環(huán)境因素。在即時型牛乳過敏反應中，Th2 途徑為主導，IL-4 和IL-13 誘導漿細胞產(chǎn)生IgE，從而導致IgE 介導的過敏。同時，Th2 分泌的IL-5 可能導致非IgE 介導的過敏，這主要是由于嗜酸性粒細胞的積累和激活引起的[4]。

圖1 過敏反應的免疫機制圖Fig.1 The immunological profile during an allergic response

CMPA 通常在嬰兒期更為嚴重[3]，會引起一系列臨床癥狀，包括皮膚（麻疹、濕疹和腫脹）、胃腸道（惡心、嘔吐、腹瀉和胃痙攣）、呼吸道（流鼻涕、鼻塞、喘息和咳嗽），甚至更嚴重的過敏性休克等反應[5]。在用母乳、配方粉混合喂養(yǎng)的嬰兒中，由于飲食中包含牛乳蛋白，同樣可以列入CMPA的研究。在僅用母乳喂養(yǎng)的嬰兒中，牛乳蛋白過敏的發(fā)生率很低。此外，母乳中存在的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，以及母乳和配方粉喂養(yǎng)的嬰兒中腸道菌群組成的重要差異，也是影響CMPA 發(fā)生的重要因素[6]。

關于熱加工降低食物致敏性的研究已經(jīng)有許多報道[7?10]。本文重點討論非熱加工包括酶解、高壓、微波、發(fā)酵及其輔助酶解對于牛乳過敏原的結構和致敏性的影響，及其在制備低致敏嬰兒配方粉方面的應用,為新型低或無致敏嬰兒配方粉的生產(chǎn)提供理論基礎，也對今后非熱加工技術的發(fā)展和研究提出建議。

1 CMPA的管理

通過限制或改變飲食，避免食用牛乳蛋白，一般可以預防和改善嬰兒過敏性疾病。但是，很多食品中往往添加有牛乳蛋白，完全避免食用是不現(xiàn)實的。對于處于骨骼生長期的兒童，牛乳也是鈣的重要來源[11]。因此，改性牛乳蛋白以加強對CMPA的管理顯得格外重要[12]。食品工業(yè)中，降低牛乳蛋白致敏性的方法主要包括熱處理[13?15]、微波加熱[16?18]、酶解[19?21]、乳酸菌發(fā)酵或水解[22?24]、高壓[25?28]以及水解與高壓、微波等技術的聯(lián)合應用等[29?32]。非熱加工技術，對牛乳的營養(yǎng)組成和感官特性影響小，同時又能降低牛乳蛋白質(zhì)的致敏性，成為近年來研究的關注點。“低致敏食品”便相應產(chǎn)生，雖然目前沒有任何法律上的定義或標準來規(guī)范這一概念，但相較于天然食物，這類食品在體內(nèi)可顯著降低過敏反應發(fā)生的幾率[33?34]。那些經(jīng)過食品加工技術（水解、熱處理和/或超濾）處理的能破壞或者滅活IgE 結合表位的牛乳配方食品[35]，也屬于“低致敏食品”范疇。雙盲、安慰劑對照試驗表明，這類食品可以使90%（95%的置信度）以上的過敏個體具有良好的耐受性[33?34]。

2 乳致敏蛋白及其表位

牛乳蛋白在過敏反應中的作用機制尚不清楚[36]。牛乳含有大約30～35 g/L的蛋白質(zhì)，含25 種以上不同的蛋白質(zhì)，但過敏原往往只是其中幾種[37]。一般來說，根據(jù)蛋白質(zhì)在低pH 下溶解度的差異，牛乳蛋白可分為酪蛋白（80%）和乳清蛋白（20%）兩類。酪蛋白（casein，CN）組分在pH4.6 下不溶，主要包括α?s1?、α?s2?、β-和κ-酪蛋白4 種組分，比例分別為4:1:4:1。乳清蛋白在pH4.6 條件下可溶，包括β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）和α-乳白蛋白（αlactalbumin，ALA），還包括少量的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶和免疫球蛋白等[38]。臨床研究表明，患CMPA的兒童對牛乳中過敏原的B 細胞表位發(fā)生過敏反應，這些表位可能存在于蛋白質(zhì)序列的任何區(qū)域。引起兒童過敏反應的主要牛乳過敏原為BLG、ALA 和αs1-CN。對已知的主要過敏原分子特征進行研究，有助于提高過敏者產(chǎn)生牛乳耐受性的治療方案的制定，并可為生產(chǎn)低致敏配方粉提供技術支持[39]。

β-乳球蛋白（BLG）占乳清蛋白總量的50%，免疫反應序列有規(guī)律地分布在BLG 分子的162 個氨基酸殘基上，其中一些是短的線性序列，而另一些是構成構象表位的大片段。BLG 中有3 個肽已被確定為主要的致敏表位，包括f41～60，f102～124 和f149～162。根據(jù)其晶體結構，f149-162 肽的C 端形成了一個短的α-螺旋[40]。Jarvinen 等[41]在BLG 分子上鑒定了7 個（片段：1～16、31～48、47～60、67～78、75～86 和127～144）IgE 結合以及4 個（片段：49～60、119～128、129～138 和143～152）IgG 結合區(qū)域。利用丙氨酸掃描分析，鑒定了氨基酸序列f17～36、f72～86、f92～106 和f152～166 為IgE 結合表位[42]。另外，肽f41-60 和f102-142 在分子表面形成環(huán)，抗體也可以接觸到它們[43]?；谖㈥嚵械拿庖叻治黾夹g表明，75%以上的患者可識別f58～77、f76～95 和f121～140 序列[44]。

ALA 是一種單體球狀蛋白質(zhì)，由123 個氨基酸殘基組成，分子量為14.4 kDa，有4 個二硫鍵[45]。序列分析表明，牛乳與人乳ALA的氨基酸序列之間具有高度的同源性約75%的相似性。盡管如此，牛乳ALA 已經(jīng)被確定為主要牛乳過敏原之一[37]。已經(jīng)鑒定了ALA 上的4 個（片段：1～16、13～26、47～58和93～102）IgE 結合以及3 個（片段：7～18、51～61和89～108）IgG 結合區(qū)域[41]。另一項關于CMPA 變應原性的研究表明，ALA 氨基酸序列中有5 個IgE 結合位點，包括f1～15、f6～20、f46～60、f71～85和f101～115。另外，分別在f6～20、f21～35、f36～50和f86～100 處鑒定了4 個IgG 結合表位[44]。

αs1-CN 是由199 個氨基酸殘基組成的單鏈線性磷酸蛋白，是牛乳中含量較高的蛋白質(zhì)，被認為是酪蛋白中最有效的誘導特定過敏反應的蛋白。這種蛋白質(zhì)只有少量的二級結構（α-螺旋或β-片層），由于缺乏二硫鍵，導致三級相互作用減少[45]。使用重疊的十肽，在αs1-CN 上已經(jīng)鑒定了六個主要（片段：17～36、83～102、109～120、139～154、159～174 和173～194）和三個次要（片段：39～48、69～78 和123～132）IgE 結合以及5 個主要（片段：15～36、93～108、143～160、159～174 和173～186）和一個次要（片 段：1～10）IgG 結合區(qū)域，其中f69～78 和f173～194 兩個IgE 結合表位可能有助于預測單個患者的CMPA，并且，表位f69～78 被大多數(shù)患者的IgE 抗體識別，但沒有被任何患者的IgG 識別，這種差異可以通過IgE 和IgG 抗體對該表位的不同親和力來解釋，但也可以表明表位是造成過敏原特異性的原因。此外，Spuergin 等[46]對αs1-CN的三個肽序 列（片 段：19～30、86～103 和141～150）進行了表征，它們與15 名過敏患者的血清發(fā)生了反應，這些表位位于分子的疏水區(qū)域，只有在酪蛋白變性后這些表位才能接觸到抗體。Cerecedo 等[47]研究表明，75%以上的患者識別了f16～35、f28～50 和f73～92。本團隊通過丙氨酸掃描分析法在αs1-CN 中發(fā)現(xiàn)了IgE 結合表位（片段：aa6～20，aa11～25，aa76～90，aa126～140，aa171～185）和IgG 結合表位（片段：aa21～35，aa56～70，aa161～175），并且發(fā)現(xiàn)兩個氨基酸區(qū)域與IgE 和IgG 均發(fā)生免疫反應[45]。以上研究中，表位的序列定位不同，這可能與不同國家的血清學差異有關，另外，與不同的研究方法也有關，比如，在持續(xù)性CMPA 中，αs1-CN的IgE 和IgG 識別模式支持線性表位。

與αs1-CN 相比，關于β-CN 和κ-CN的致敏表位的數(shù)據(jù)非常少。在β-CN 中鑒定了6 個主要（片段：1～16、55～70、83～92、107～120、135～144 和185～208）和3 個次要（片段：149～164、167～178、173～184）IgE結合表位，以及八個主要（片段：1～14、23～34、55～68、79～92、107～120、135～144、149～160 和183～208）和一個次要（片段：169～184）IgG 結合表位。同樣，在κ-CN 中檢測到8 個主要的（片段：9～26、21～44、47～68、67～78、95～116、111～126、137～148 和149～166）IgE 結合表位，以及2 個主要的（片段：55～80 和105～116）和2 個次要的（片段：15-24 和37-46）IgG結合表位[48?49]。Cerecedo 等[47]證實75%以上的患者在αs2-CN 中識別了f1～20、f13～32、f67～86 和f181～207的氨基酸序列，在β-CN 中識別了f25～50、f52～74 和f154～173的氨基酸序列，在κ-CN 中識別了f34～53的氨基酸序列。

目前，對于介導牛乳蛋白過敏的IgE 或IgG的機制及二者相互轉化的機理仍有較大的爭議，造成這種情況的原因可能是，研究群體的不同，研究群體選擇標準不同及樣本量小。

3 非熱加工牛乳過敏原處理技術

3.1 高壓輔助酶解處理

高壓（high pressure，HP）會影響蛋白質(zhì)氫鍵、離子鍵、疏水鍵等非共價鍵，破壞三級、四級結構，但對共價鍵沒有影響[27,50]。研究表明，HP 可以通過影響食物過敏原的結構來改變過敏原的致敏性[26,28]。在高壓下水解蛋白質(zhì)是一種新的底物酶解方法，但僅在高壓條件下蛋白質(zhì)是幾乎不水解的。HP 可以改變蛋白質(zhì)分子內(nèi)和蛋白質(zhì)-溶劑之間相互作用的平衡，壓力引起的蛋白質(zhì)變化的程度取決于蛋白質(zhì)的天然結構、離子強度、溫度、溶劑、pH 和施加壓力的水平等因素。因此，壓力可以有效地促進酶對蛋白質(zhì)的水解作用[29]。

可以采用HHP 與食品級酶的聯(lián)合作用來減少抗原蛋白[26]。酶結合高靜水壓（high hydrostatic pressure，HHP）處理得到的牛乳蛋白水解物可用于低致敏性嬰兒配方粉的生產(chǎn)[31]。與熱處理效應相比，HP 過程中蛋白質(zhì)的變性和聚集存在顯著差異。研究人員發(fā)現(xiàn)，用HP 處理的乳清蛋白水解物的抗原性低于熱處理的水解產(chǎn)物[50]。除了HP 對牛乳蛋白過敏性的積極影響外，一些研究報道了這種處理的負面影響[27]。Kleber 等[27]的研究結果表明，牛乳過敏原BLG 經(jīng)200～600 MPa HHP 處理后反而變得更加活躍，HHP 會增加過敏原BLG的致敏性，因為結構的改變可能會暴露出新的線性表位，增加與IgE的結合機會。

雖然最早用HP 處理的食物是牛乳，有許多研究集中在HP 對牛乳的改性上，但到目前為止，HP 處理的牛乳產(chǎn)品還沒有商業(yè)化生產(chǎn)。限制這項技術應用的主要因素是成本，因為HP 處理是一項昂貴的技術，而且，相比其他食物的變化，HP 引起的牛乳變化還需要更進一步研究[51]。

3.2 微波輔助酶解處理

微波（microwave irradiation，MWI）是一種高頻電磁波，屬于非電離輻射，在該系統(tǒng)中，溫度升高不同于傳統(tǒng)加熱方式，是通過吸收微波能量來實現(xiàn)的，微波能量的吸收通過偶極水分子的旋轉和物質(zhì)的離子組分的平移來實現(xiàn)。微波可以影響牛乳蛋白構象變化，加速其變性[16,29]。另外，據(jù)報道經(jīng)微波處理后過敏原上的表位結構發(fā)生了改變，由此可見，微波技術可用于降低蛋白質(zhì)的致敏性[52]。

乳清蛋白（ALA 和BLG）經(jīng)微波處理后失去了部分IgG 結合能力，但其抗原活性并未完全消除。事實上，微波本身不足以大大降低或完全消除BLG的抗原性，因此應與其他處理方式（如酶處理）或內(nèi)在參數(shù)（pH）相結合來應用[17]。

近年來，對微波和酶法聯(lián)合降低乳清蛋白的抗原性進行了多項研究[30,32,53]。這些研究表明，MWI 提高了BLG 和乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）的水解速率，在200 W的微波處理3 min，顯著提高了胃蛋白酶對BLG的水解速度，并且顯著降低了其免疫反應性。但是，微波輔助胰蛋白酶、糜蛋白酶以及兩種酶的混合物處理BLG 和WPI，所得深度水解物與IgE 結合沒有影響[32]。Izquiedo 等[30]研究表明，鏈霉蛋白酶和糜蛋白酶在MWI 下顯示出較高的活性，可以加速BLG 水解。一年后，這些作者分析了MWI 對鏈霉蛋白酶、糜蛋白酶和5 種食品級酶（木瓜蛋白酶、Corolase7089、PN-L100、堿性蛋白酶和中性蛋白酶）水解乳清蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶能產(chǎn)生更有效的低致敏乳水解產(chǎn)物，并且能夠降低產(chǎn)品的苦味[53]。

因此，MWI 輔助酶處理得到的乳蛋白水解物可以作為eHFs 中多肽的來源。雖然微波輔助酶解是降低BLG 致敏性和生產(chǎn)低致敏配方粉的有效方法，但是進一步揭示MWI 對乳蛋白（如BLG 等）致敏特性影響機制非常有必要。

3.3 發(fā)酵輔助酶解處理

發(fā)酵是食品工業(yè)中最古老的加工技術。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）發(fā)酵過程中牛乳蛋白發(fā)生水解反應可能對提高牛乳消化率和加速生物活性肽的產(chǎn)生有重要影響。而且，蛋白水解可以破壞過敏原的作用表位，降低牛乳的致敏性[23]。最近，人們對乳酸菌的免疫調(diào)節(jié)機制產(chǎn)生了很高的興趣。一些微生物、動物或植物的蛋白酶也被用來水解牛乳蛋白，降低其抗原性，然而，在水解過程中產(chǎn)生的一些苦味肽極大地影響了低致敏乳制品的開發(fā)。而乳酸菌發(fā)酵過程中的水解作用不僅降低了乳蛋白的抗原性，并且水解物口感良好富集較多生物活性物質(zhì)[23]。

乳酸菌發(fā)酵是降低乳清蛋白抗原性的適宜方法。有研究表明，與生乳相比，在經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵的滅菌牛乳中，乳清蛋白的抗原性降低了99%以上[22]。Bu 等[23]證實乳清蛋白的抗原性在乳酸菌發(fā)酵后顯著降低，與未發(fā)酵牛乳相比，ALA的抗原抑制率為53%～87%，BLG的抗原抑制率為86%～95%，BLG抗原抑制率高于ALA，這一結果可能是由于一些乳酸菌蛋白酶對BLG的水解能力高于ALA，而且BLG的熱穩(wěn)定性比ALA 差，發(fā)酵前的預熱處理會導致BLG 構象結構的變性和展開，使得BLG 更容易水解。并且，在降低乳清蛋白的抗原性方面，相較于單獨使用，瑞士乳桿菌和嗜熱鏈球菌的聯(lián)合使用是最有效的，菌株之間的協(xié)同效應及機制需要深入研究[23]。

最近，將水解酶與益生菌結合開發(fā)新型功能性水解物，使得水解蛋白的應用領域更加廣闊。已經(jīng)證明益生菌在減少過敏患者癥狀方面的有益作用，將益生菌添加到低致敏配方粉是一種創(chuàng)新的預防和治療食物過敏的模式[54]。鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）是研究最多的益生菌，當添加到eHF 中時有明顯的益處，LGG 降低了特應性皮炎的嚴重程度，減少了腸道炎癥，更快地誘導了患有CMPA的嬰兒的耐受性，并改善了過敏性結腸炎的恢復[2]。然而，歐洲兒科胃腸病學和營養(yǎng)學會（European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition，ESPGHAN）認為，這些新型配方粉仍然不完全令人滿意，因為配方中添加的益生菌的真正安全性尚未得到充分評估[55]。通過體內(nèi)外試驗繼續(xù)開展益生菌脫敏機制研究，建立其安全性評價機制是未來重點研究內(nèi)容。

表1 總結了一些關于非熱加工技術處理牛乳過敏原的研究結論。

表1 非熱法改性CMPA的研究列表Table 1 List of some studies about modification of CMPA by non-thermal methods

4 部分、深度和完全酶解過敏原水解物在嬰兒配方粉中的應用

一些蛋白質(zhì)的致敏性可以通過蛋白酶的水解來降低。為了充分降低變應原性和超敏性，嘗試將牛乳蛋白質(zhì)水解成小肽和游離氨基酸[60]，開發(fā)用于過敏嬰兒日常食用的無致敏配方粉或臨床用于治療幼兒過敏的低致敏配方粉。然而，問題是這些水解物往往風味差，有苦味，脂質(zhì)乳化性低，氨基酸類配方粉增加機體滲透壓而且成本高，因此，開發(fā)無致敏性的、適口的部分水解配方粉是解決問題的關鍵所在[61]。

牛乳蛋白部分水解配方粉最早是由雀巢公司（超級能恩）于1985 年推出的[62]。隨后，其他品牌適合牛乳過敏嬰幼兒食用的配方粉陸續(xù)上市，其中有些品牌的部分水解配方粉（partially hydrolyzed formula，pHF）或深度水解配方粉（extensively hydrolysed formula，eHF）仍存在過敏原B 細胞表位，并可引起過敏反應[63]。研究表明，在pHF 和eHF 之間BLG殘留量存在很大的差異。pHF的BLG 水平是eHF的40000 倍[64]。然而，目前尚不清楚哪種水解物在抑制過敏和天然嬰兒喂養(yǎng)中更可?。慌c常規(guī)配方粉相比，pHF 似乎是更好的替代品[11]。而且，就成本和口味偏好而言，pHF 優(yōu)于大多數(shù)eHF[64]。雖然沒有明確的eHF 和pHF的定義，但這兩種嬰兒配方粉已經(jīng)開發(fā)市售。水解嬰兒配方粉由于蛋白質(zhì)來源、水解程度、蛋白酶種類、輔助加工技術（如熱加工）和肽譜不同而有差異，過敏原殘留可能仍然存在[11]。配方粉中殘留的抗原性取決于在制備過程中應用的水解和過濾技術的程度，因此，建議在CMPA 嬰兒飲食中引入水解配方粉之前，應首先確認其安全性[65]。將嬰兒配方粉標記為低致敏性的主要標準是:通過雙盲試驗、安慰劑對照試驗確認為90%的CMPA的兒童或嬰兒沒有表現(xiàn)出過敏反應[66]。

在pHF 和eHF 研究的基礎上，發(fā)展了完全水解或氨基酸配方粉（amino acid-derived formulas，AAF）。研究表明，使用AAF 可以大大降低致敏反應[12]。建議給eHF 過敏、生長遲緩或多種食物過敏的嬰兒補充AAF[12]。AAF 不能廣泛地應用的主要問題是高成本和相當不愉快的口味[67]。一些研究中指出，eHFs 和AAFs 是低致敏性的，而pHFs 未列入，因為它所引起的過敏反應是不可預期的[68]。市售部分低致敏配方粉如表2 所示[69]。

表2 市售低致敏配方粉Table 2 Examples of commercially hypoallergenic infant formula

續(xù)表 2

5 結論與展望

CMPA 兒童選擇替代食品主要取決于兩個因素，即營養(yǎng)充足性和無致敏性，除此之外，還要考慮到成本和口味。非熱加工技術中的酶水解方法已被廣泛應用于低或無致敏配方粉的生產(chǎn)，它具有成本低、條件溫和的優(yōu)點。目前存在的問題是，一些市售牛乳蛋白水解配方粉仍存在致敏性，深度水解配方粉可能會影響非致敏乳蛋白的功能性質(zhì)，另外，水解處理釋放的疏水多肽會產(chǎn)生苦味。因此，為了生產(chǎn)安全、營養(yǎng)、完全無致敏的配方粉，人們對新的非熱加工技術寄予厚望。將不同的非熱加工工藝結合在一起，例如發(fā)酵和動植物源的蛋白酶的結合，可以減少水解物苦味值；高壓、微波與酶水解結合，可以使隱性B 細胞作用表位最大程度的暴露并被水解，降低水解物的潛在致敏性。這些新策略的具體效果仍然需要進一步研究，但是一些理論研究數(shù)據(jù)確實顯示了令人滿意的結果。近年來，關于益生菌的抗過敏機制研究取得了初步成效，還需要深入分析益生菌的抗過敏調(diào)控途徑和不同菌株之間的協(xié)同效應，建立其在無致敏配方粉中的添加標準。應用非熱加工技術，開發(fā)營養(yǎng)、完全、無致敏的、適口的嬰幼兒配方粉應該作為未來重點研究方向。

另外，盡管目前低或無致敏嬰幼兒配方粉的生產(chǎn)以GB25596 為準則，但是仍有一些現(xiàn)實問題需要深入探究，比如，除了過敏原發(fā)生了水解，其他功能性乳蛋白也發(fā)生了水解，乳蛋白質(zhì)的生理功能如何保證？乳水解物中的多肽是否具有生物活性，這些生物活性多肽是否具有免疫調(diào)節(jié)的功能？開發(fā)配方粉是基于母乳研究，低或無致敏嬰幼兒配方粉的生理功能是否與母乳的生理功能有差異？因此，深入分析低或無致敏嬰幼兒配方粉與母乳營養(yǎng)成分、生理功能的差異是未來重點開展的工作，在保證無致敏的同時，也要考慮到水解作用對非致敏乳蛋白質(zhì)尤其是免疫球蛋白類物質(zhì)的影響，保障配方粉中非致敏乳蛋白質(zhì)的生理功能和有效攝入；明確低或無致敏乳蛋白水解物中游離多肽和氨基酸的分布和生理功能，及其與母乳中游離多肽、氨基酸的差異，開發(fā)具有母乳化功能的低或無致敏嬰幼兒配方粉。