楊慧芬 毛娟娟

1.浙江省杭州市中醫(yī)院乳腺科，浙江杭州 310007；2.浙江省寧波市中醫(yī)院外二科，浙江寧波 315012

乳腺癌全球新發(fā)病例已超肺癌位居首位，嚴重危害女性身心健康[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2 均呈陰性的乳腺癌，生存率低，惡性程度高，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，且無理想治療靶點[2]。順鉑（Cisplatin，CDDP）是治療TNBC 的有效手段之一，但易產(chǎn)生耐藥性影響化療效果[3]。因此逆轉(zhuǎn)CDDP 的耐藥性對治療TNBC 具有重要意義。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）可介導(dǎo)腫瘤細胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境，并參與腫瘤細胞的耐藥形成[4-5]。二至丸合桂枝湯可降低MDAMB-231 細胞中HIF-1α 蛋白表達，并抑制細胞生長。由此，二至丸合桂枝湯可能通過調(diào)控細胞HIF-1α 的表達參與TNBC 細胞CDDP 耐受機制。首先制備CDDP 耐藥細胞株（MDA-MB-231/CDDP），并給予二至丸合桂枝湯和CDDP 干預(yù)，探討二至丸合桂枝湯對MDA-MB-231/CDDP 細胞株的CDDP 的耐受及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

20 只SPF 級SD 大鼠，體重（200±30）g，購于上海斯萊克動物實驗有限公司[SCXK（滬）2017-0015]，在標準環(huán)境下[溫度（23±2）℃，濕度為55%～70%，12 h光/暗循環(huán)]飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心[（浙）2020-0024）]，自由飲食飲水。所有動物實驗均參照實驗動物保護和使用的指南[6]，并經(jīng)杭州鷹旸生物科技有限公司倫理委員會批準。

1.2 實驗材料與儀器

人乳腺癌細胞MDA-MB-231（貨號：iCell-h133）購于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。二至丸合桂枝湯方劑（炙甘草6 g，桂枝、芍藥、生姜各9 g，女貞子、旱蓮草各10 g，大棗12 枚，水煎，濃縮至1 g/ml，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?。HIF-1α（1∶500，AF1009）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（1∶500，AF5131）、GAPDH（1∶3000，AF7021）抗體購于Affinity。CCK8 試劑盒（貨號：HY-K0301）購于MCE；MTT 試劑盒（貨號：E606334-0500）購于BBI Life Sciences；細胞凋亡試劑盒（貨號：556547）購于BD。LightCycler?96實時熒光定量PCR儀購于Roche羅氏；Nanodrop one mRNA 定量儀購于Thermo Scientific；Mastercycler 普通PCR 儀購于Eppendorf。

1.3 耐藥細胞株的建立及細胞活力檢測

采用藥物連續(xù)誘導(dǎo)法篩選耐藥細胞。取對數(shù)生長期MDA-MB-231 細胞接種于含CDDP 及10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，CDDP 濃度為0.01、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L 逐步誘導(dǎo)，作用48 h 后換新培養(yǎng)液，每2～3 天傳代1 次，歷時6 個月[7]。

MDA-MB-231/CDDP、MDA-MB-231 細 胞（2×104/ml，100 μl/孔）接種于96 孔板，加終濃度為0.01、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L 的CDDP，同時以未加入CDDP 的樣孔作為對照組，培養(yǎng)48 h 后，加入10 μl/孔CCK-8 試劑，混勻，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。用酶標儀測定450 nm 處的吸光度，計算細胞活性，各平行測定6 個復(fù)孔。

1.4 含二至丸合桂枝湯血清制備

20 只健康大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和二至丸合桂枝湯給藥組，每組10 只，具體分組方法為，將大鼠依次編為1～20 號，然后任意從隨機數(shù)字表的某一行某一數(shù)字開始抄錄20 個數(shù)，令單數(shù)代表對照組，雙數(shù)代表二至丸合桂枝湯給藥組。對照組給予蒸餾水，其余大鼠給予8.5 g/（kg·d）二至丸合桂枝湯，連續(xù)灌胃給藥7 d 后，經(jīng)腹主動脈收集5 ml 血標本靜置后離心，同組上清液合并，滅活過濾-80℃冰箱保存。

1.5 給藥分組及細胞活力檢測

將MDA-MB-231/CDDP 細胞株隨機分為以下四組：空白組（不做任何處理）、二至丸合桂枝湯組（200 μg/ml 二至丸合桂枝湯）、CDDP 組（10 μmol/L CDDP）、聯(lián)合組（200 μg/ml 二至丸合桂枝湯+10 μmol/L CDDP）。各組細胞置于DMEM 高糖培養(yǎng)基、5% CO2、37℃恒濕孵箱環(huán)境中培養(yǎng)24、48 h 后，用CCK-8 試劑檢測24、48 h 的細胞活力，各組平行測定6 個復(fù)孔。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

取各組對數(shù)生長期細胞（1.2×106個細胞/孔）接種于6 孔板。處理48 h 后，洗滌，調(diào)整為1×106個/ml。用結(jié)合緩沖液洗滌后重懸于100 μl 結(jié)合緩沖液，與5 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI 室溫避光反應(yīng)15 min。加入400 μl 結(jié)合緩沖液1 h 內(nèi)檢測。實驗重復(fù)3 次。

1.7 定量反轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcriptasemediated PCR，qRT-PCR）

利用qRT-PCR 檢測不同劑量CDDP 對MDAMB-231細胞、MDA-MB-231/CDDP細胞中VEGF、HIF-1α mRNA 表達情況及上述“1.5”分組中VEGF、HIF-1α mRNA 表達情況。提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，特異性擴增VEGF、HIF-1α，GAPDH 為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95℃，10 min 變性；95℃，15 s；60℃，60 s；40次循環(huán)。采用2-△△Ct方法計算VEGF、HIF-1α mRNA 表達量。HIF-1α：正向引物：5’-GGCGCGAACGACAAGAAAAAG-3’，反向引物：5’-CTTATCAAGATGCGAACTCACA-3’；VEGF：正向引物：5’-CAGCGCAGCTACTGCCATC-CAATCGAGA-3’，反向引物：5’-GCTTGTCACATCTGCAATGCAAGTACGTTCGTTTA-3’；GAPDH：正向引物：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向引物：5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。

1.8 Western blot

利用Western blot 檢測不同劑量CDDP 對MDAMB-231細胞、MDA-MB-231/CDDP細胞中VEGF、HIF-1α 蛋白表達情況及上述“1.5”分組中VEGF、HIF-1α 蛋白表達情況。RIPA 提取蛋白，BCA 試劑盒測定總蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST 洗膜。行免疫印跡，封閉后，加一抗稀釋液（VEGF、HIF-1α），4℃孵育過夜，加入二抗[IgG H&L（HRP），稀釋倍數(shù)為1∶3000]，室溫反應(yīng)1～2 h。以GAPDH 為內(nèi)參?；瘜W(xué)發(fā)光儀顯影。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗，多組計量資料比較采用單因素方差分析，方差齊者采用SNK-q 檢驗，方差不齊者，組間兩兩比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDDP 對兩種細胞活性的影響

CDDP 濃度分別為0.1 μmol/L 和0.5 μmol/L 時，MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP 細胞活性均低于相應(yīng)對照組（不用CDDP 處理）的細胞活力，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。且MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP 細胞對CDDP 的IC50值分別為1.6001 μmol/L和36.4320 μmol/L。見圖1。

圖1 不同劑量CDDP 對MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP 細胞活性的影響

2.2 CDDP 對兩種細胞中VEGF、HIF-1α mRNA 表達的影響

CDDP 濃度為0.1 μmol/L 的MDA-MB-231 細胞中HIF-1α mRNA 表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），CDDP 濃度為0.5、1、5、10 μmol/L 的MDA-MB-231、MDA-MB-231/CDDP 細胞中VEGF、HIF-1α mRNA 表達水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。CDDP 濃度為10 μmol/L時，MDA-MB-231/CDDP 細胞中VEGF mRNA 表達水平高于MDA-MB-231 細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 不同劑量CDDP 對MDA-MB-231、MDA-MB-231/CDDP 細胞中VEGF、HIF-1α mRNA 表達情況的影響

2.3 CDDP 對兩種細胞中HIF-1α、VEGF 蛋白表達的影響

CDDP 濃度為1、5、10 μmol/L 的MDA-MB-231細胞中HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），MDA-MB-231/CDDP 細胞HIF-1α 蛋白表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；MDA-MB-231/CDDP 細胞各組間VEGF 蛋白表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。當(dāng)CDDP 濃度為5、10 μmol/L 時，MDA-MB-231/CDDP 細胞中HIF-1α蛋白表達水平高于MDA-MB-231 細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。當(dāng)CDDP 濃度為1、10 μmol/L 時，MDA-MB-231/CDDP 細胞中VEGF 蛋白表達水平高于MDA-MB-231 細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。因此，選擇10 μmol/L CDDP 進行后續(xù)實驗。見圖3。

圖3 不同劑量CDDP 對MDA-MB-231、MDA-MB-231/CDDP 細胞中VEGF、HIF-1α 蛋白表達情況的影響

2.4 二至丸合桂枝湯聯(lián)合CDDP 抑制MDA-MB-231/CDDP 細胞活性

作用24 h 后，二至丸合桂枝湯組細胞存活率與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。CDDP 組和聯(lián)合組細胞存活率均低于空白組，聯(lián)合組細胞存活率低于CDDP 組和二至丸合桂枝湯組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。作用48 h 后，二至丸合桂枝湯組、CDDP 組和聯(lián)合組細胞存活率均低于空白組，聯(lián)合組細胞存活率低于CDDP 組和二至丸合桂枝湯組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖4。

圖4 各組MDA-MB-231/CDDP 細胞活性變化情況

2.5 二至丸合桂枝湯聯(lián)合CDDP 促進MDA-MB-231/CDDP 細胞凋亡

二至丸合桂枝湯組、CDDP 組和聯(lián)合組細胞凋亡率均高于空白組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01），其中，聯(lián)合組細胞凋亡率高于二至丸合桂枝湯組及CDDP 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖5。

圖5 各組MDA-MB-231/CDDP 細胞凋亡情況

2.6 二至丸合桂枝湯調(diào)控HIF-1α 信號通路逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231/CDDP 細胞的CDDP 耐藥性

CDDP 組和聯(lián)合組MDA-MB-231/CDDP 細胞中HIF-1α、VEGF mRNA 及蛋白表達水平均低于空白組，聯(lián)合組低于二至丸合桂枝湯組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖6。

圖6 各組MDA-MB-231/CDDP 細胞中VEGF、HIF-1α 表達情況

3 討論

CDDP 是治療TNBC 常用化療藥物之一，與雙功能烷化劑類似，可與DNA 共價結(jié)合，生成Pt-DNA，阻滯細胞周期，抑制DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進而誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。然而胞內(nèi)CDDP 積累降低、腫瘤微環(huán)境變化、DNA 損傷修復(fù)增加或凋亡信號通路改變等導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生，限制了其療效[9-11]。故逆轉(zhuǎn)CDDP 耐藥性對治療TNBC 有重要意義。近年來，中藥在逆轉(zhuǎn)CDDP 耐藥性方面中具有獨特的優(yōu)勢[12]。

HIF-1α 與腫瘤細胞耐藥形成密切相關(guān)[5]，可通過激活MDR-1 基因，上調(diào)耐藥蛋白P 糖蛋白表達，將藥物泵出細胞膜外。同時調(diào)控癌細胞的增殖與存活，拮抗B 細胞淋巴瘤2 家族蛋白等抗凋亡因子表達，引起自噬；此外，還可抑制DNA 損傷，調(diào)控代謝重組等[13-14]。VEGF 是HIF-1α 下游靶基因，在腫瘤新生血管生成過程中具有重要作用。腫瘤細胞缺氧時，可激活HIF-1α，誘導(dǎo)VEGF 轉(zhuǎn)錄和表達，結(jié)合特異性受體，調(diào)控血管內(nèi)皮的遷移與增殖，并改變管壁的結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)腫瘤細胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境[15-16]。此外，PI3K/AKT/HIF-1α信號通路可逆轉(zhuǎn)5-氟尿嘧啶耐藥性，抑制糖酵解，增強抗腫瘤活性[17]；抑制HIF-1α 表達可介導(dǎo)肝癌細胞對Sorafenib 的耐藥性[18-19]。本研究制備的MDAMB-231/CDDP 細胞株對CDDP 敏感性降低，在待定的CDDP 濃度干預(yù)下，對VEGF、HIF-1α mRNA 及蛋白表達水平高于MDA-MB-231 細胞。

二至丸合桂枝湯可有效改善絕經(jīng)前Luminal 型乳腺癌患者的生殖激素水平，對TNBC 也具有良好的療效[20-23]。現(xiàn)代藥理研究表明，二至丸合桂枝湯中的芍藥苷具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗抑郁、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[24]；女貞子具有抗腫瘤活性，并參與細胞凋亡[25]。聯(lián)合組可顯著抑制耐藥腫瘤細胞活性。并降低HIF-1α、VEGF mRNA 及蛋白表達水平。提示二至丸合桂枝湯可抑制HIF-1α 信號通路，下調(diào)VEGF 表達，從而逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231/CDDP 細胞的CDDP 耐藥性。

細胞凋亡是化療殺傷腫瘤細胞的共同路徑，也是腫瘤細胞耐藥的作用機制之一[26]。低氧狀態(tài)下，HIF-1α對細胞凋亡的影響與缺氧程度、原癌基因轉(zhuǎn)錄條件有關(guān)[27]。本研究中，二至丸合桂枝湯可促進CDDP 誘導(dǎo)的MDA-MB-231/CDDP 細胞凋亡，可能是由于二至丸合桂枝湯促進CDDP 激活的HIF-1α 上調(diào)BNIP3表達，抑制抗凋亡蛋白，誘導(dǎo)MDA-MB-231/CDDP 細胞凋亡[28]。

因此，二至丸合桂枝湯可通過調(diào)控HIF-1α 信號通路，下調(diào)VEGF 表達，逆轉(zhuǎn)TNBC 細胞系的CDDP耐藥性。