彭湃，楊軍，邱勇

膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性腦腫瘤，其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，易轉(zhuǎn)移，其治療方式仍以手術(shù)切除為主，同時(shí)輔以放、化療，然而目前膠質(zhì)瘤的治療效果還不盡如人意。研究表明很多腫瘤病人在術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，影響病人生存率，而麻醉藥可影響腫瘤的微轉(zhuǎn)移。氯普魯卡因（chloroprocaine，CP）是一類新型的酯類高效局麻藥，其起效快、效果確切、不良反應(yīng)小、麻醉效應(yīng)強(qiáng)，麻醉后恢復(fù)快的優(yōu)點(diǎn)。研究報(bào)道CP可抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa和CaSki增殖，誘導(dǎo)抑癌基因上皮型鈣黏蛋白1（epithelial cadherin 1，CDH1）、結(jié)腸腺瘤性息肉病基因（adenomatous polyp?osis coli，APC）及P16啟動(dòng)子去甲基化。CP可抑制乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞活力和遷移。Titin 反義RNA 1（titin antisense RNA 1，TTN-AS1）在肺腺癌的組織和細(xì)胞中上調(diào)，并與較差的總體生存率相關(guān)，TTN-AS1 可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。TTN-AS1 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。TTN-AS1 通過(guò)miR-573/E2F 轉(zhuǎn)錄因子3（E2F3）促進(jìn)宮頸癌中的細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。以上研究表明CP 具有一定的抑癌作用，TTN-AS1也與癌癥的增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)，然而CP和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）TTN-AS1 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響還尚未可知。因此，本實(shí)驗(yàn)自2019 年6—11 月研究氯普魯卡是否通過(guò)調(diào)控TTNAS1表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251 購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司；鹽酸氯普魯卡因購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司；噻唑蘭（MTT）試劑盒、RIPA 蛋白裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma；Transwell 小室、Matrigel、熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)于上海研卉生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

U251 細(xì)胞用RPMI-1640 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別用濃度為1 mmol/L、3 mmol/L、9 mmol/L 的CP 培養(yǎng)細(xì)胞作為CP低、中、高濃度組；未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。將si-NC、si-TTN-AS1 轉(zhuǎn)染至U251 細(xì)胞中，記為si-NC組、si-TTN-AS1組；將pcDNA、pcDNA-TTN-AS1轉(zhuǎn)染至U251 細(xì)胞中再用9 mmol/L 的CP 培養(yǎng)，記為CP+pcDNA組、CP+pcDNA-TTN-AS1組。

1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說(shuō)明書操作，最后檢測(cè)490 nm 處吸光度（OD）值；計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）。

1.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）等一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，再加入二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，顯影后分析蛋白條帶的灰度值。

1.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

遷移：將100 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室上室，培 養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。侵襲：用Matrigel 包被Transwell 小室上室，然后與遷移操作一樣。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)lncRNA TTN-AS1表達(dá)水平

提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說(shuō)明以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，相對(duì)表達(dá)量用2法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 CP 對(duì)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖的影響

相較于對(duì)照組，低、中、高濃度CP 處理可提高U251 細(xì)胞增殖抑制率和p21 表達(dá)水平，降低CyclinD1 表達(dá)水平，且呈濃度依賴性（

P

<0.05）。見圖1、表1。

圖1 氯普魯卡因（CP）對(duì)增殖相關(guān)蛋白的影響

表1 氯普魯卡因（CP）對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響/± s

2.2 CP 對(duì)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞遷移侵襲的影響

相較于對(duì)照組，低、中、高濃度CP處理可降低遷移侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平，呈濃度依賴性（

P

<0.05）見圖2、表2。

圖2 氯普魯卡因（CP）對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）蛋白表達(dá)的影響

表2 氯普魯卡因（CP）對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移侵襲的影響/± s

2.3 CP 對(duì)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TTN-AS1表達(dá)的影響

相較于對(duì)照組（1.00±0.09），低（0.78±0.07）、中（0.65±0.06）、高（0.52±0.05）濃度CP 處理可降低TTN-AS1 表達(dá)水平，呈濃度依賴性（

F

=78.958，

P

=0.000）。

2.4 干擾lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響

相較于si-NC 組，干擾ln?cRNA TTN-AS1 可提高細(xì)胞增殖抑制率和p21 表達(dá)水平，減少細(xì)胞遷移侵襲數(shù)，且降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平（

P

<0.05）。見圖3，表3。

表3 干擾lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響/± s

圖3 干擾lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）蛋白表達(dá)的影響

2.5 lncRNA TTN-AS1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了CP（9 mmol/L）對(duì)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用

相較于CP+pcDNA 組，CP+pcDNA-TTN-AS1 組細(xì)胞增殖抑制率和p21 表達(dá)水平降低，而遷移侵襲細(xì)胞數(shù)以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平升高（

P

<0.05）。見圖4，表4。

圖4 細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）蛋白的表達(dá)

表4 lncRNA TTN-AS1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了氯普魯卡因（CP）（9 mmol/L）對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用/± s

3 討論

復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是目前腫瘤治療的難點(diǎn)，手術(shù)是腫瘤治療的基礎(chǔ)和主要方式，研究表明局部麻醉藥可影響某些腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移。且研究報(bào)道麻醉藥也可影響膠質(zhì)瘤，研究麻醉藥對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲遷移影響，可為圍手術(shù)期合理應(yīng)用麻醉藥及改善病人預(yù)后提供新思路。有研究表明，普魯卡因可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，將腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期。羅哌卡因能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和結(jié)腸癌皮下瘤的生長(zhǎng)。利多卡因可抑制乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞侵襲、遷移。以上研究表明，不同麻醉藥均有一定的抑癌作用。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的CP 處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 后，U251 細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞遷移侵襲數(shù)減少；表明氯普魯卡可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

研究表明lncRNA 也參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究報(bào)道lncRNA TTN-AS1 在甲狀腺乳頭狀癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)水平與淋巴轉(zhuǎn)移、TNM 分期和病人的整體生存率有關(guān)，抑制TTN-AS1表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，遷移，侵襲和EMT。TTNAS1 高表達(dá)與肺腺癌病人的TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后預(yù)后差也有關(guān)，敲除TTN-AS1 可抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。沉默TNN-AS1 明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。沉默TTN-AS1 通過(guò)上調(diào)miR-1271 抑制前列腺癌的增殖和遷移。以上研究表明TNN-AS1 參與多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等過(guò)程，還與病人的生存及預(yù)后有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)抑制TN-AS1抑制可提高細(xì)胞增殖抑制，降低細(xì)胞遷移侵襲數(shù)；說(shuō)明抑制TTN-AS1 表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。用不同濃度的CP處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 后，TTN-AS1 表達(dá)水平顯著降低；而過(guò)表達(dá)TTN-AS1 逆轉(zhuǎn)了CP 對(duì)U251 細(xì)胞的作用。以上研究表明，CP 可能通過(guò)調(diào)控TTN-AS1 影響膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，CP 通過(guò)下調(diào)lncRNA TTN-AS1 表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。