白璐，馬英杰，王郁杰

內(nèi)毒素是指革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的脂多糖，當(dāng)細(xì)菌裂解或是黏附在其他細(xì)胞上時(shí)會(huì)釋放脂多糖，脂多糖含量增加會(huì)激活體內(nèi)炎性反應(yīng)，參與多種疾病進(jìn)展。機(jī)體清除內(nèi)毒素的主要器官為肝臟，肝臟也最容易受到內(nèi)毒素誘導(dǎo)損傷，內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷是多種肝臟疾病的基礎(chǔ)病理因素。現(xiàn)已有研究顯示內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷可以激活多種介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路，表明炎癥反應(yīng)是肝臟組織損傷的重要病理機(jī)制。TLR4/NF-кB 信號(hào)通路為重要的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路之一，在誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、增加炎性因子水平的過(guò)程中具有重要作用，通過(guò)抑制該信號(hào)通路的傳遞，能夠明顯降低機(jī)體組織細(xì)胞的炎癥反應(yīng)進(jìn)程。肝爽顆粒主要是由黨參、柴胡、白芍、當(dāng)歸、茯苓、白術(shù)、枳殼、蒲公英、虎杖、夏枯草、丹參、桃仁、鱉甲組成，具有疏肝健脾、清熱散淤、保肝護(hù)肝、軟堅(jiān)散結(jié)的作用，多用于急慢性肝炎、肝硬化以及肝功能損傷臨床治療。肝爽顆粒對(duì)肝組織損傷有明顯減輕作用，同時(shí)還體現(xiàn)出保肝抗炎的功效，能夠抑制mTOR信號(hào)通路，抑制肝星狀細(xì)胞活性，實(shí)現(xiàn)抗肝纖維化的功能。肝爽顆粒對(duì)肝損傷的保護(hù)作用是否可以通過(guò)影響TLR4/NF-кB 信號(hào)通路傳遞來(lái)發(fā)揮其功能，尚不清楚。因此，本研究自2019 年5―10 月通過(guò)肝損傷大鼠模型來(lái)探索肝爽顆粒對(duì)其可能存在的作用機(jī)制，為肝爽顆粒用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

肝爽顆粒（保定天浩制藥有限公司，批號(hào)Z20027671）、LPS（L4391）、D-GalN（G0500）均購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司，白介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）試劑盒（YAD23684S，北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）ELISA 試劑盒（SBJ-R0785，南京森貝伽生物科技有限公司），白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（JK-a-0023）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 試劑盒［JK-（a）-1752）均購(gòu)于上海晶抗生物工程有限公司］，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（QYBM10200，上海喬羽生物科技有限公司），丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（0-100860，上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司），原位末端標(biāo)記法（TUNEL）凋亡試劑盒（T2190，上海恒斐生物科技有限公司），Bcl-2相關(guān)X（Bax）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、TLR4、Myd88、核因子κB（NF-κB）抗體購(gòu)于武漢博歐特生物科技有限公司。

熒光顯微鏡（DMi8-電動(dòng)，徠卡），離心機(jī)（5430/5430R，Eppendorf），石蠟切片機(jī)（Finesse ME+，賽默飛）。

1.2 動(dòng)物及分組

SPF 級(jí)SD 雄性健康大鼠50 只，4～5 周齡，體質(zhì)量（190±20）g，購(gòu)于湖南嘉泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2015-0006，購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，培育室溫度為20～25 ℃，濕度40%～50%，人工光照晝夜時(shí)間各12 h，飲水自由。本研究中對(duì)于大鼠的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。將50 只SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法均分成5 組，分別為對(duì)照組、模型組、肝爽顆粒低劑量組、肝爽顆粒中劑量組、肝爽顆粒高劑量組。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

肝爽顆粒低劑量組、肝爽顆粒中劑量組、肝爽顆粒高劑量組分別灌胃1.8 g/kg、3.6 g/kg、7.2 g/kg 肝爽顆粒，1 次/天，連續(xù)灌胃1 周；對(duì)照組、模型組灌胃等體積生理鹽水，1 次/天，連續(xù)灌胃1周，末次給藥后1 h，用于肝損傷大鼠模型制備。

肝損傷大鼠模型制備方法參考文獻(xiàn)，模型制備前禁食12 h，飲水自由，腹腔注射LPS（20 μg/kg）、D-GalN（400 mg/kg），對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水，造模12 h后，進(jìn)行各指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

腹腔注射LPS（20 μg/kg）、D-GalN（400 mg/kg）12 h 后，麻醉處死大鼠，取出肝臟組織，一部分肝臟組織制備成肝臟勻漿，用于檢測(cè)肝臟組織中的MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-1β、IL-6 水平；一部分肝臟組織用于細(xì)胞凋亡、TLR4/NF-кB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平檢測(cè)。

1.5 TUNEL 檢測(cè)

將已固定好的肝臟組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，5 μm 切片，參考TUNEL 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行肝臟組織凋亡檢測(cè)，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)不重疊視野，記錄100 個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色的細(xì)胞核，計(jì)算出細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)

提取肝臟組織總蛋白，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，加入Bax、Bcl-2、TLR4、Myd88、NF-κB、β-actin 一抗，于4 ℃條件下孵育過(guò)夜，再用TBST 漂洗40 min，分為3 次漂洗，再加入經(jīng)HRP 標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育1 h，根據(jù)ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影、定影，觀察各組蛋白條帶成像情況，并進(jìn)行蛋白條帶分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織凋亡情況比較

取各組大鼠肝臟組織進(jìn)行TUNEL 檢測(cè)，比較各組大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，模型組、1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（

P

<0.05）；1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡率均明顯低于模型組（

P

<0.05），且隨著肝爽顆粒劑量逐漸增加，大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡率逐漸降低，見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組大鼠肝臟組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cas?pase-3）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X（Bax）蛋白水平及凋亡率比較/（%，± s）

圖1 各組肝臟組織TUNEL檢測(cè)結(jié)果（TUNEL×200）：A為對(duì)照組；B為模型組；C為1.8 g/kg肝爽顆粒組；D為3.6 g/kg肝爽顆粒組；E為7.2 g/kg肝爽顆粒組

采用Western blotting 檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中Bax、Bcl-2蛋白水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組與1.8 g/kg肝爽顆粒組、3.6 g/kg肝爽顆粒組、7.2 g/kg肝爽顆粒組大鼠肝臟組織中Bax蛋白含量均明顯升高（

P

<0.05），Bcl-2 蛋白水平均顯著降低（

P

<0.05）；與模型相比1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組大鼠肝臟組織中Bax蛋白水平降低（

P

<0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（

P

<0.05），見(jiàn)圖2、表1。

圖2 各組肝臟組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Bax、Bcl-2蛋白水平凝膠成像結(jié)果

2.2 各組大鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px 水平比較

將各組大鼠肝臟組織制備成肝臟組織勻漿，經(jīng)離心取上清液，采用ELISA 法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中MDA、SOD、GSH-Px水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組MDA 含量增加（

P

<0.05），SOD、GSH-Px活性降低（

P

<0.05）；與模型相比，1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組MDA 含量降低（

P

<0.05），而SOD、GSH-Px 活性升高（

P

<0.05），且隨著肝爽顆粒給藥劑量增加，這種趨勢(shì)更明顯，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝臟組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）比較/± s

2.3 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量比較

取各組大鼠肝臟組織制備成肝臟組織勻漿，經(jīng)離心取上清液，采用ELISA 法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg肝爽顆粒組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯增加（

P

<0.05）；與模型相比，1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg肝爽顆粒組、7.2 g/kg肝爽顆粒組TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均明顯降低（

P

<0.05），且隨著肝爽顆粒給藥劑量增加，降低趨勢(shì)更明顯，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肝臟組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）含量比較/± s

2.4 肝爽顆粒對(duì)肝損傷大鼠TLR4/NF-кB 信號(hào)通路的影響

提取各組大鼠肝臟組織總蛋白，采用Western blotting 檢測(cè)各組組織中的TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白水平均明顯升高（

P

<0.05）；與模型組相比，1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白水平均明顯降低，且隨著肝爽顆粒給藥劑量增加，降低趨勢(shì)更明顯，見(jiàn)圖3、表4。

表4 各組大鼠肝臟組織TLR4、MyD88、核因子κB（NF-κB）蛋白水平比較/（%，± s）

圖3 各組肝臟組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白凝膠成像結(jié)果

3 討論

急性肝損傷為多種肝病進(jìn)展為肝功能衰竭的中間環(huán)節(jié)，引起急性肝損傷的因素眾多，常見(jiàn)因素有肝組織缺氧缺血、代謝異常、中毒及感染等。我國(guó)病毒性肝炎患者較多，LSP 是誘導(dǎo)肝損傷的重要因素，能夠激活單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性因子，使機(jī)體組織器官產(chǎn)生損傷。D-GalN 是核苷酸干擾劑，能夠阻礙肝臟組織細(xì)胞尿苷三磷酸合成，引起肝臟組織炎癥反應(yīng)與組織壞死，降低肝臟對(duì)LPS的解毒功能，加重機(jī)體肝組織損傷，這點(diǎn)與病毒性肝炎病理特點(diǎn)相似。因此，本研究選擇LPS/DGalN腹腔注射來(lái)制備急性肝損傷大鼠模型。

Liu 等研究發(fā)現(xiàn)肝爽顆粒可以通過(guò)抑制小鼠模型中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)肝硬化的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)LPS/D-GalN 可以促進(jìn)大鼠肝組織凋亡，降低Bcl-2 蛋白水平，增加Bax 蛋白含量，肝爽顆粒預(yù)處理可以降低肝損傷大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率，升高Bcl-2 蛋白水平，降低Bax 蛋白含量。線(xiàn)粒體途徑在細(xì)胞凋亡途徑中具有重要作用，其結(jié)構(gòu)及功能受損，使線(xiàn)粒體膜電位下降，激活Caspase-9，使Cas?pase-3 蛋白含量增加，加快細(xì)胞凋亡。Bcl-2 家族為由線(xiàn)粒體途介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的是重要的調(diào)節(jié)因素，Bcl-2 含量增加可以抑制細(xì)胞凋亡，Bax 含量增加促進(jìn)細(xì)胞凋亡。王晶等認(rèn)為黨參水提取物可以穩(wěn)定D-半乳糖致衰小鼠肝脾結(jié)構(gòu)，降低Bax 蛋白水平，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)小鼠肝脾組織有明顯的保護(hù)作用。黨參為肝爽顆粒中藥組成之一，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果趨勢(shì)相似，表明肝爽顆粒對(duì)肝損傷大鼠的肝臟組織細(xì)胞凋亡有抑制作用，可能是通過(guò)促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的急性肝損傷會(huì)激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子，還能引起肝組織細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示模型組大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡率明顯增加，且肝臟組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平升高，SOD、GSH-Px 活性明顯減低。SOD活性降低會(huì)使細(xì)胞膜不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)容易受自由基破壞，促進(jìn)脂質(zhì)分解產(chǎn)生MDA，引起線(xiàn)粒體膜的通透性發(fā)生改變，影響線(xiàn)粒體功能。GSH-Px可以清除活性氧誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化物，促進(jìn)過(guò)氧化氫的分解，保護(hù)細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)及其功能的完整。TNF-α、IL-1β、IL-6 是典型的炎性因子，其水平變化也反映了機(jī)體的炎性反應(yīng)情況。肝爽顆粒中的丹參總酚酸可以對(duì)小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用，可以降低小鼠血清IL-6、TNF-α 水平。柴胡也是肝爽顆粒的中藥成分，有研究顯示柴胡皂苷-b2 可以降低由四氯化碳引起急性小鼠肝損傷，可以降低小鼠MDA水平，增加SOD 活性，推測(cè)其保護(hù)肝組織損傷作用機(jī)制可能是通過(guò)改善氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果趨勢(shì)相似，由此推測(cè)肝爽顆粒對(duì)大鼠急性肝損害的改善作用，也可能是通過(guò)緩解LPS/D-GalN 誘導(dǎo)大鼠的肝組織炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激來(lái)實(shí)現(xiàn)。

肝臟巨噬細(xì)胞可以分泌TNF-α、IL-1β、IL-6 炎性因子，TNF-α、IL-1β、IL-6 一方面可以通過(guò)作用于肝細(xì)胞表面受體，促進(jìn)肝臟細(xì)胞壞死，另一方面還可以激活NF-кB 信號(hào)通路，以正反饋方式促進(jìn)其自身含量增加，進(jìn)一步加劇肝臟組織損傷。本研究結(jié)果顯示，由LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠肝臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白水平明顯增加，而肝爽顆?？梢砸种七@種增長(zhǎng)趨勢(shì)。NF-кB信號(hào)通路是介導(dǎo)機(jī)體肝臟組織炎性反應(yīng)的重要作用途徑，中TLR4、MyD88、NF-κB 在肝臟組織炎性反應(yīng)中有協(xié)同作用。脂多糖可以激活TLR4 信號(hào)，激活TLR4下游的MyD88，引起肝臟組織炎性反應(yīng)并釋放炎性因子。MyD88既是TLR4的轉(zhuǎn)接蛋白，又為NF-кB連接蛋白，胞外炎癥信號(hào)通過(guò)TLR4 傳遞給MyD88，促使MyD88與IRAK4相互作用，使IRAK4磷酸化并作用于TAB-1/TAB-2，激活TAB-1，再接著作用于NF-κB，激活I(lǐng)κB 激酶。在上游信號(hào)后刺激后，在IKK 作用下IκB 磷酸化激活，可進(jìn)一步釋放炎性細(xì)胞因子，炎性因子含量增加又可進(jìn)一步激活NF-κB，因此TLR4-MyD88-NF-κB 信號(hào)通路在肝臟炎癥反應(yīng)中具有重要作用。李文燕等研究顯示樟芝多糖可以通過(guò)下調(diào)TLR4-MyD88-NF-κB 表達(dá)來(lái)降低LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡以及急性肝損傷，同時(shí)在免疫組化實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)肝損傷中NF-кB信號(hào)呈現(xiàn)出激活狀態(tài)。Zhang 等研究顯示LPS 低劑量連續(xù)預(yù)處理可以改善LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的急性肝衰竭，起作用機(jī)制是通過(guò)抑制NF-кB 信號(hào)通路活化，從而有助于肝臟抵抗LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的肝損傷。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相似，由此推測(cè)，肝爽顆粒對(duì)LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，可能是通過(guò)抑制TLR4/NF-кB 信號(hào)通路活化，從而減少大鼠肝組織損傷，降低肝組織炎性反應(yīng)。

綜上所述，肝爽顆粒可能是通過(guò)降低Bax 蛋白水平，增加Bcl-2蛋白水平來(lái)降低急性肝損傷大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率；還可以降低肝臟組織TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平，增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性，增強(qiáng)大鼠機(jī)體抗氧化應(yīng)激、抗炎性能力，可能與抑制TLR4/NF-кB 信號(hào)通路有關(guān)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)及功能的保護(hù)作用。本研究所得結(jié)論僅限于大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其他種類(lèi)動(dòng)物或臨床上是否具有相似的趨勢(shì)，還需要進(jìn)一步研究。