李豐環(huán) 康麗君

山東省煙臺市煙臺山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，山東煙臺 264000

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要亞型，占所有肺癌病例的85%[1-2]。NSCLC 早期臨床癥狀并不明顯，大多數(shù)患者在診斷時已進入晚期，嚴(yán)重影響其預(yù)后，因此闡明NSCLC 的潛在機制對改善患者的不良預(yù)后極為重要。丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDHc）存在于線粒體中，是細胞有氧氧化過程中重要的調(diào)控位點[3]。PDHcE1α亞單位（PDHcE1α subunit，PDHA1）是PDHc 的活性位點，PDHc 的磷酸化和去磷酸化可調(diào)節(jié)其活性，進而調(diào)節(jié)細胞代謝過程[4]。有研究表明，當(dāng)敲低食管癌組織中PDHA1 的表達時，可引起瓦爾堡效應(yīng)，增強腫瘤細胞的遷移能力和對化療藥物的耐藥性[5]。鳥苷酸結(jié)合蛋白1（guanylate binding protein 1，GBP1）屬于GTP酶超家族，正常人皮膚及組織中不表達GBP1，當(dāng)GBP1 表達升高時，表明可能有炎癥反應(yīng)的發(fā)生[6]。據(jù)報道[7-8]，GBP1 可調(diào)節(jié)口腔鱗狀細胞癌細胞的遷移和侵襲，但具體生物學(xué)機制尚不清楚。因此，本研究旨在分析NSCLC 組織中PDHA1 與GBP1 的表達及其與預(yù)后的關(guān)系，為臨床治療提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月至2017 年10 月山東省煙臺市煙臺山醫(yī)院收治的84 例NSCLC 患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)活檢病理或術(shù)后病理檢查明確診斷為NSCLC。②均為首次診斷NSCLC，未接受放化療。③臨床病理資料完整并接受隨訪，且均通過患者及家屬的同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有同系統(tǒng)其他相關(guān)疾病，如肺炎、支氣管炎等。②重要臟器疾病，如冠心病、肝硬化等。③患有其他系統(tǒng)疾病或者惡性腫瘤，如胃癌、結(jié)腸癌等。從患者出院日起，每1～3 個月隨訪1 次，包括門診隨訪或電話隨訪，隨訪時間共36 個月，隨訪截至2020 年10 月或患者死亡，收集患者生存數(shù)據(jù)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測NSCLC 癌組織及癌旁組織（距離腫瘤邊緣大于5 cm 的癌旁正常組織）PDHA1 與GBP1 的表達情況，將取出的癌組織及癌旁組織置于凍存管中，-70℃保存。①將組織甲醛固定后石蠟包埋、切片，將切片恒溫烘烤30 min。②依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟，無水乙醇中水化15 min，磷酸鹽緩沖液清洗3 次，5 min/次。③將切片放入盛有枸櫞酸緩沖液的容器中，加熱至100℃10 min，冷卻清洗，再浸入3%H2O2室溫孵育20 min，清洗。④分別滴加100 μl PDHA1 和GBP1 一抗（稀釋比例1∶300，購自美國Abcam 公司，批號：20160102），4℃冰箱冷藏過夜，次日取出清洗，滴加100 μl PDHA1 和GBP1 二抗（稀釋比例1∶300，購自美國Abcam 公司，批號：20151209），室溫放置30 min，清洗。⑤滴加辣根過氧化物酶，室溫放置30 min 后清洗。⑥D(zhuǎn)AB 顯色5 min，流水沖洗，蘇木精復(fù)染，流水沖洗后封片，染色方法為酶標(biāo)聚合物法，PDHA1 與GBP1 主要表達于細胞漿中，由專業(yè)病理科醫(yī)師進行顯微鏡鏡檢（400×），觀察10 個高倍視野，共計數(shù)100 個細胞，根據(jù)細胞的染色強度和細胞陽性百分率綜合計算分?jǐn)?shù)。未著色記為0 分，淺黃色記為1 分，棕黃色記為2 分，棕褐色記為3 分；細胞陽性率≤5%0 分，＞5%～25%1 分，＞25%～50%2 分，＞50%～100%為3 分，根據(jù)以上兩項結(jié)果得分相乘，0～3 分視為陰性，＞3 分為陽性[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。Kaplan-Meier 繪制生存曲線，采用Long-rank 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 患者癌組織及癌旁組織中PDHA1 與GBP1 的表達比較

NSCLC 患者癌組織及癌旁組織中PDHA1 與GBP1的表達情況見圖1～2（封四）。NSCLC 患者癌組織中PDHA1 陽性率為35.71%（30/84），癌旁組織中PDHA1 陽性率為63.10%（53/84），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.597，P ＜0.001）。癌組織中GBP1 陽性表達率為69.05%（58/84），癌旁組織中GBP1 陽性表達率為30.95%（26/84），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=24.381，P ＜0.001）。

圖1 非小細胞肺癌患者癌組織及癌旁組織中PDHA1的表達

圖2 非小細胞肺癌患者癌組織及癌旁組織中GBP1的表達

2.2 NSCLC 組織中PDHA1 和GBP1 的表達情況與患者預(yù)后的關(guān)系

84 例NSCLC 患者均隨訪成功，無失訪病例。隨訪3 年內(nèi)，共有31 例死亡。PDHA1 陽性組死亡6 例，3 年生存率為80.00%（24/30），PDHA1 陰性組死亡25 例，3 年生存率為53.70%（29/54）。PDHA1 陽性組3 年生存率高于PDHA1 陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.274，P=0.029）。見圖3。GBP1 陽性組死亡24 例，3 年生存率為58.62%（34/58），陰性組死亡7 例，3 年生存率為73.08%（19/26），GBP1 陽性組3 年生存率低于GBP1 陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.231，P=0.036）。見圖4。

圖3 PDHA1 陽性組與PDHA1 陰性組的生存曲線

圖4 GBP1 陽性組與GBP1 陰性組的生存曲線

3 討論

NSCLC 是呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于有吸煙史及有家族史者，根據(jù)NSCLC 病理分型，可將其分為鱗癌、腺癌、大細胞癌、腺鱗癌和唾液腺型腫瘤[9-10]。NSCLC 常見的臨床癥狀有咳嗽、咯血、呼吸困難及胸痛等，到晚期可合并其他系統(tǒng)疾病，如病理性骨折[11]。NSCLC 的主要治療手段包括手術(shù)切除、放療、化療及靶向治療等[12-13]。NSCLC通常在早期已發(fā)生轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差，盡管目前醫(yī)療技術(shù)得到了很大程度的提升，但晚期NSCLC 患者的預(yù)后及生存情況仍不容樂觀。因此，研究NSCLC 發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制顯得尤為重要。

PDHc 是細胞代謝過程中重要的限速酶之一，可在細胞代謝過程中供給能量，有助于細胞的生長發(fā)育[14-15]。PDHA1 基因位置為Xp22.12，全長約17.5 kb，由12 個外顯子組成，編碼長度約為390 個氨基酸肽鏈。PDHA1是PDHc 的活性調(diào)控位點，PDHA1 的表達狀態(tài)影響著PDHc 的活性，如敲低PDHA1 的表達可使得PDHc失活并減緩細胞生長過程[16]。PDHA1 蛋白在多種疾病中下調(diào)，如癲癇、亞急性壞死性腦脊髓病等[17-18]。有研究顯示，低表達的PDHA1 與卵巢癌的預(yù)后不良相關(guān)，PDHA1 可通過影響細胞代謝過程、基因突變進而參與腫瘤的惡性進展過程[19]。本研究結(jié)果顯示，PDHA1在NSCLC 患者組織中表達下調(diào)，相關(guān)文獻顯示，PDHA1表達降低時會導(dǎo)致細胞內(nèi)的活性氧水平降低，上調(diào)絲氨酸/蘇氨酸Akt 激酶的表達并進一步激活大腦皮質(zhì)缺血周圍區(qū)磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt 激酶信號通路，該通路的激活促進了細胞周期蛋白D1 的表達，從而加快了細胞的生長周期，減少細胞凋亡，對腫瘤細胞的生長分化起到了促進作用，提高了腫瘤的臨床分期，增加了腫瘤的惡性程度[20]。另一方面，PDHA1 的低表達使PDHc 的活性降低，導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化水平下降，糖酵解增加，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[21]。

GBP1 屬于GTP 酶家族，基因位于X 染色體上，由GTP 酶活性區(qū)、效應(yīng)區(qū)及鏈接二者的中間結(jié)構(gòu)組成[22]。相關(guān)文獻顯示，GBP1 可抑制水皰型口炎病毒及腦心肌炎病毒的復(fù)制，當(dāng)敲低GBP1 的表達時，病毒的復(fù)制卻明顯增強[23]；過表達的GBP1 可刺激表皮生長因子受體通路與p53 信號通路的表達，進而誘導(dǎo)食管癌細胞的淋巴轉(zhuǎn)移，并與食管癌的不良預(yù)后相關(guān)[24]。但GBP1 在NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，GBP1 在NSCLC 組織中表達上調(diào)，提示GBP1 可能參與了NSCLC 的發(fā)生發(fā)展過程。相關(guān)研究結(jié)果顯示，Wnt 基因已被鑒定為癌基因，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路通過調(diào)控胚胎發(fā)育、細胞增殖及分化過程，進而在惡性腫瘤的發(fā)生中起著極其重要的促進作用[24-26]，高表達的GBP1 可激活該通路中β-連環(huán)蛋白的表達，進而促進腫瘤細胞的增殖、分化及浸潤，對腫瘤的發(fā)展過程起到了促進作用。此外，高表達的GBP1 還可通過介導(dǎo)γ 干擾素對腫瘤細胞的凋亡起到抑制作用，加快腫瘤的癌變進展[4]。本研究中PDHA1陽性組3 年生存率高于PDHA1 陰性組，GBP1 陽性組患者3 年生存率低于GBP1 陰性組，提示PDHA1 與GBP1 可能與NSCLC 患者的預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，NSCLC 組織中PDHA1 和GBP1 表達異常，二者有望成為新的NSCLC 預(yù)后評估的分子標(biāo)志物。但二者在NSCLC 的發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制還需要大樣本量的研究來深入探索。