童雙禮 吳潔 李莎莎 桑軍軍1,

[1.福建醫(yī)科大學?？偱R床醫(yī)學院(第九○○醫(yī)院)燒傷整形科，福州 350001；2.福建醫(yī)科大學?？偱R床醫(yī)學院皮膚科，福州 350001；3.32231部隊衛(wèi)生所，福州 350001；4.廈門大學附屬東方醫(yī)院，福州 350001]

新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)是一種普遍存在于自然環(huán)境中的機會性致病真菌，艾滋病患者等免疫缺陷人群和免疫正常人群都可受累,能引起多種部位的感染，其中以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染最為常見，預后也最為嚴重，可引發(fā)致命性的腦膜腦炎[1]。根據(jù)最新的流行病學研究估計，全球艾滋病患者中每年約有菌感染約278 000例，而感染死亡患者約181 000例[2]。

37℃生長、莢膜、黑色素、尿素酶等是目前已知的新生隱球菌的毒力因子[3]。蛋白酶在維持真菌生理正常功能中扮演著重要的角色[4]。新生隱球菌絲氨酸蛋白酶被認為是隱球菌的潛在毒力因子，但其在隱球菌感染中的作用和地位還未明確[5]。本研究中，我們通過基因敲除獲得了絲氨酸蛋白酶家族基因中SER5(CNAG_02494)的基因缺失株，并對其表型和功能進行了初步探究。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗菌株和引物 本研究中使用的菌株為新生隱球菌格魯比變種標準菌株H99，質(zhì)粒為pJL517、pCH233，使用的引物見表1。

表1 本實驗中使用的引物Tab.1 Primers used in this study

培養(yǎng)基、實驗藥品及試劑 YPD液體培養(yǎng)基(1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖)、YPD固體培養(yǎng)基(1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂)、山梨醇培養(yǎng)基(YPD+1 mol/L山梨醇)、選擇培養(yǎng)基(YPD+200mg/L G418/Neomycin，YPD+100 mg/L Nourseothricin)、LB(0.5%酵母膏、1%蛋白胨、0.5%氯化鈉)、LA(LB+100mg/L Ampicilin)、LK(LB+100 mg/L Kanamycin)、YNB培養(yǎng)基(0.67%酵母基本氮源、2%瓊脂)、應激培養(yǎng)基(YPD或YNB加入對應的藥劑)、In-Fusion?HD Cloning Kit、High-Fidelity DNA Polymerase、標準培養(yǎng)皿、鑷子、玻璃珠、試管、細胞計數(shù)器、PBS等。

主要儀器和器材 實驗中主要用到的儀器包括Bio-Rad 真空凍干機、Thermo高速離心機、Bio-Rad基因槍、超凈臺、30℃恒溫培養(yǎng)箱、37℃恒溫培養(yǎng)箱、39℃培養(yǎng)箱、天平、搖床、水浴鍋、電泳凝膠成像分析系統(tǒng)、Bio-Rad PCR儀、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、酶標儀等。

1.2 方法

菌株保存與培養(yǎng) 新生隱球菌菌株在含10%甘油YPD液體培養(yǎng)基中于-80℃冰箱中保藏，使用時劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2 d，取單克隆單克隆菌落在YPD液體培養(yǎng)基30℃搖菌過夜。

基因敲除與回復 以H99基因組為模版，合成基因編碼區(qū)兩端各1 000 bp左右的DNA片段，以pJL517為模版合成抗性篩選基因片段，使用overlap PCR的方法連接基因上游片段，抗性基因片段以及基因下游片段。取隱球菌單克隆菌落搖菌、清洗、重懸后加入YPD+1 mol/L山梨醇培養(yǎng)基，用玻璃珠涂勻，30℃孵育備用。純化和濃縮上述獲得的DNA片段，將金粉與DNA混勻，基因槍轟擊平鋪于YPD+1 mol/L山梨醇培養(yǎng)基的隱球菌。將樣品放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，加入刮板，將菌懸液轉移至選擇培養(yǎng)基，30℃孵育3～5 d，選取10個單克隆轉移到YPD培養(yǎng)基，重復2次，再將菌落轉移到選擇培養(yǎng)基，確認抗性穩(wěn)定，使用PCR驗證。PCR構建回復基因片段，包含基因編碼區(qū)，及其前后各1 000 bp的區(qū)域，同時將pCH233線性化，通過In-Fusion HD Cloning Kits合成質(zhì)粒，選取驗證后敲除基因的菌株，按上述方法通過基因槍轉化，選擇培養(yǎng)基篩選回復株，選取陽性克隆的驗證。

體外應激應答檢測 挑取單克隆搖菌、清洗、重懸，將濃度最終調(diào)整為2.5×108cells/mL，將配好濃度的菌懸液加入到96孔板中，倍比稀釋成6個濃度，分別為2.5×108cells/mL、2.5×107cells/mL、2.5×106cells/mL、2.5×105cells/mL、2.5×104cells/mL、2.5×103cells/mL備用。依照配方制備新鮮培養(yǎng)基，所需配方見實驗材料培養(yǎng)基。使用排槍每孔取4 μL的菌液，平行點到培養(yǎng)基上。干燥后放入相應的溫度下培養(yǎng)3～5 d，將相應的培養(yǎng)基生長結果照相。

黑色素誘導實驗 配制菌懸液濃度到2.5×108cells/mL，取4 μL滴入DOPA培養(yǎng)板，分別置于30℃和37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、5、7 d，并分別拍照。

隱球菌莢膜的誘導 將隱球菌在沙堡弱液體培養(yǎng)基中搖菌過夜，離心洗滌后使用PBS稀釋10倍的沙堡弱液體培養(yǎng)基(加入MOPS緩沖液調(diào)整至50 mmol/L)配制濃度為5×106cells/mL于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h拍照，使用ImageJ軟件每株測量80～100個內(nèi)外徑長度。

隱球菌尿素酶檢測 配制2.5×108cells/mL菌懸液，取4 μL加入尿素培養(yǎng)板，分別放入30℃和37℃培養(yǎng)箱，24 h后拍照。

生長曲線的測定 配制菌懸液濃度為1×106cells/mL、1×103cells/mL，將200 μL菌懸液加入96孔板中，37℃每隔6 h在OD600讀數(shù)，將讀數(shù)錄入GraphPad Prime5繪制生長曲線。

酵母雙雜交實驗 以SER5基因cDNA為誘餌構建膜酵母雙雜交誘餌載體，篩選膜酵母雙雜交pPR3N-FW cDNA文庫，經(jīng)過對陽性克隆的多重報告基因檢測、DNA測序和BLAST比對分析，確定與Ser5相互作用的蛋白基因。

2 結 果

2.1 基因敲除菌及回復株構建成功

通過PCR擴增Ser5編碼片段，敲除株Ser5編碼片段沒有出現(xiàn)，回復株Ser5編碼片段陽性，說明ser5Δ，ser5Δ+SER5構建成功。鑒定結果見圖1。

圖1 SER5基因敲除及回復驗證PCR電泳結果Fig.1 Validation of SER5 gene knocking-out and reconstitution

2.2 體外應激實驗

ser5Δ在不同溫度下、氧化應激、高鹽高滲、細胞壁應激培養(yǎng)基生長與野生株和回復株相比無明顯差異(見圖2)，提示絲氨酸蛋白酶Ser5對隱球菌溫度敏感性、氧化應激、高鹽高滲耐受及細胞壁功能完整性沒有顯著影響。

圖2 體外應激實驗：A.溫度；B.硝化應激和氧化應激；C.高鹽高滲；D.細胞膜和細胞壁應激ser5Δ無明顯變化Fig.2 The phenotypes of ser5Δ mutants in stress: A. Temperature sensitivity; B. Oxidative and nitrosative stress C. High salts and osmotic stress; D. Cell-wall and cell-membrane stress. ser5Δ didn’t show increased sensitivity to stress compared to WT and ser5Δ +SER5 reconstituted strains.

2.3 Ser5參與黑色素的誘導

ser5Δ在30℃培養(yǎng)表現(xiàn)為黑色素生成顯著減少，黑色素的缺失在37℃更加明顯(見圖3)。當SER5基因回復時，ser5Δ+SER5恢復了黑色素產(chǎn)生能力，說明SER5在黑色素誘導過程中發(fā)揮作用。

圖3 菌株在左旋多巴培養(yǎng)基黑色素誘導實驗 ser5Δ在30℃培養(yǎng)表現(xiàn)為黑色素生成顯著減少，黑色素的減少在37℃更加明顯；回復株ser 5Δ+SER5 恢復了黑色素生成能力。Fig.3 Growth of ser mutants on L-DOPA media. ser 5Δ exhibited melanin synthesis decreasing on DOPA medium 30℃,and this defect was exacerbated at 37℃, and the phenotype was recuperated in the ser 5Δ+SER5 reconstituted strains

2.4 Ser5對隱球菌莢膜無明顯影響

ser5Δ對隱球菌莢膜誘導無顯著影響，莢膜大小與野生株和回復株無明顯差異(P>0.05，見圖4),提示Ser5對莢膜合成無顯著影響。莢膜大小的比較取外徑與內(nèi)徑的比值，統(tǒng)計使用SPSS 18.0進行單因素方差分析，以P<0.05視為有統(tǒng)計學意義。

2.5 Ser5對尿素酶無明顯影響

在30℃和37℃下，ser5Δ分解尿素能力與野生株和回復株無明顯差異(見圖5)，提示Ser5對隱球菌尿素酶無顯著影響。

圖4 莢膜誘導實驗：A.莢膜誘導后墨汁染色；B.莢膜厚度統(tǒng)計. ser5Δ莢膜無明顯變化 圖5 尿素酶實驗：ser5Δ對尿素分解能力無明顯變化Fig.4 Capsule growth on diluted Sabouraud's medium. A: Picture of a representative cell in an India Ink suspension. B: Measurement of the capsule size for the samples described above. The size of the capsule in ser5Δ showed no significant difference compared to WT and ser5Δ +SER5 reconstituted strains Fig.5 Growth of ser mutants on urea media. ser5Δ exhibited normal urease ability

2.6 Ser5不影響隱球菌的生長速率

在37℃下，ser5Δ在低濃度和高濃度下生長速率與野生株和回復株相比未見明顯差異(見圖6)，提示Ser5不影響隱球菌的生長速率。

圖6 生長速度實驗：A.起始濃度103 /mL；B.起始濃度106 /mL. ser5Δ生長無明顯變化Fig.6 The mutants grown rates at 37℃. A. Cell density at 103 cells/mL; B. Cell density at 106 cells/mL. ser5Δ showed normal grown rate

2.7 Ser5可能與19種蛋白存在相互作用。

酵母雙雜交文庫中篩選到了32個酵母初始陽性菌落，經(jīng)過初步鑒定，32個全部能激活ADE2、HIS3和LacZ報告基因，通過抽提陽性克隆質(zhì)粒DNA進行測序和BLAST比對分析，去除多次測序無結果和查無結果克隆，篩選出28個陽性克隆分別屬于19種不同的蛋白編碼基因(見表2)。

表2 回轉驗證Ser 5的相互作用蛋白基因列表Tab.2 The list of interacting protein genes of Ser 5

3 討 論

蛋白酶一直被認為是病原性真菌的毒力因子之一，很多病原性真菌在體外或感染時會分泌蛋白酶[6]，有研究表明，隱球菌蛋白酶可能與隱球菌從肺泡侵入肺組織以及通過血腦屏障過程中起重要作用[7-9]，而絲氨酸蛋白酶是最大的一類蛋白酶家族。有研究表明，新生隱球菌Ser5編碼基因在體內(nèi)，體外CSF，YPD生長時持續(xù)高表達且差異明顯[10]，為了進一步研究SER5基因的功能，本研究構建了SER5基因的缺失菌株，通過表型分析發(fā)現(xiàn)Ser5可影響新生隱球菌黑色素的生成。黑色素是保護真菌抵御氧化、化學和物理降解的重要物質(zhì)，可以保護菌體在體內(nèi)被免疫細胞氧化殺傷[11]。在新生隱球菌中，黑色素合成機制目前尚不清楚，黑色素的合成涉及到合成、轉運、聚集、沉積的過程，是在漆酶的作用下在小囊泡或者黑色素小體上進行，然后含有黑色素的轉運囊泡將黑色素運送到細胞壁上形成黑色素環(huán)，被黑色素環(huán)覆蓋的隱球菌對氧化刺激、酸性環(huán)境、冷熱壓力及抗生素有更強的抵抗性[12]。黑色素合成的影響因素很多，其關鍵酶是漆酶(Lac1)，其他因素包括溫度、多價陽離子、泛素、轉錄因子等[13]，但目前尚無絲氨酸蛋白酶影響黑色素生成的報道。

為了進一步研究Ser5影響黑色素合成的可能機制，通過酵母雙雜交技術篩選了與Ser5相互作用的蛋白。在與Ser5相互作用的蛋白中，包含囊泡相關膜蛋白VAMP7(XM_012190826.1，CNAG_07029)、甾醇還原酶ERG4(XM_012192772.1，CNAG_02830)[14]、磷脂轉運蛋白(XM_012192724.1，CNAG_02761)[15]、GDP-甘露糖轉運蛋白GMT1(XM_012195163.1，CNAG_05817)[16]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定蛋白YOP1(XM_012195364.1，CNAG_06646)[17]、乙醇胺磷酸轉移酶(XM_012195294.1，CNAG_06543)、膜泡運輸t-SNAREs同源物Vti1a(XM_012195775.1, CNAG_03306)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(XM_012190932.1，CNAG_00469)、天冬氨酸轉移酶(XM_012197702.1, CNAG_06026)等。上述與Ser5相互作用蛋白中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定蛋白可能與黑色素合成相關，VAMP7、磷脂轉運蛋白、Gmt1、Vti1a可能與黑色素膜泡運輸相關，提示Ser5可能參與黑色素的合成或轉運過程。

綜上，本研究成功構建了SER5基因的缺失菌株, 通過體外應激應答、黑色素誘導、莢膜誘導、尿素酶測定、生長曲線測定、酵母雙雜交實驗探究SER5基因在新生隱球菌中的功能，結果SER5基因敲除后，新生隱球菌對外界應激反應、莢膜、生長、尿素酶無明顯變化，黑色素合成顯著減少，提示Ser5在新生隱球菌黑色素合成中發(fā)揮著重要作用，通過酵母雙雜交實驗，篩選了部分與Ser5相互作用的蛋白，為進一步研究Ser5的功能提供了研究基礎，相關蛋白的具體作用機制尚需進一步的分子研究來證實。