高永政，林渝凱，劉先檔，謝昊，呂威廷，李遠(yuǎn)兆，鄭錦花通信作者)

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西 桂林 541000)

0 引言

2015年國家癌癥中心的數(shù)據(jù)顯示中國的肺癌發(fā)生率、死亡率均居于首位，而肺腺癌作為非小細(xì)胞肺癌的主要病理類型之一，在中國女性肺癌中比例達(dá)到50%[1]。確診時(shí)已是TNM分期的Ⅲ期和Ⅳ期，伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血道轉(zhuǎn)移等臨床病理特征，五年生存率低。肺腺癌的發(fā)生機(jī)制主要與致癌基因的激活與抑癌基因失活或被抑制相關(guān)，發(fā)展機(jī)制主要通過各類信號通路實(shí)現(xiàn)，相關(guān)臨床藥物治療靶點(diǎn)目前較為明確的是EGFR突變、ALK重排等[2]，因而目前肺腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確，需要探索和發(fā)現(xiàn)更多有效的肺腺癌診斷標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)用于干預(yù)和阻斷癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。

本文選擇的兩個分子為Reptin、Has2，Reptin (TIP49B /RUVBL2)是AAA+ ATPases家族成員之一，其基因RUVBL2位于人染色體的19q13.33，具有ATP酶和DNA解旋酶活性，且RUVBL2與RUVBL1(Pontin)結(jié)合[3]，作為調(diào)控基因表達(dá)的上游調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。而Has (Hyaluronan Synthase)家族包含Has1、Has2、Has3，在成人中主要表達(dá)Has2[4]，且HAS2基因位于人染色體8q24.13[5]，通過參與透明質(zhì)酸的合成對細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測肺腺癌組織及癌旁組織中兩種蛋白的表達(dá)情況，分析其表達(dá)的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科確診的2009年4月至2016年12月臨床資料完備的肺腺癌117例。

1.2 病例收集

通過收集病人病歷和隨訪獲取相關(guān)數(shù)據(jù)，隨訪采用電話采訪和信訪兩種方式。收集的信息包括：姓名、性別、年齡等基本情況，腫瘤臨床分期、病理分級以及生存狀況和生存時(shí)間等特征。根據(jù)TNM分期(2017)的臨床評價(jià)進(jìn)行分期；病理分級分為Ⅰ級(高分化腺癌)、Ⅱ級(中分化腺癌)、Ⅲ級(低分化腺癌)；病人跟蹤隨訪截止時(shí)間為2016年12月30 日，獲得的病人結(jié)局有兩種：死亡和存活。以上經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核通過。

1.3 方法與結(jié)果判定

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色法

抗體：兔抗人Reptin抗體、兔抗人Has2抗體。(BIOSS公司)

試劑盒：二步法免疫組化檢測系統(tǒng) (2-step plus Poly-HRP Anti-Mouse/Rabbit Ig G Detection System, PV-9000) 和DAB檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.3.2 結(jié)果判定方法

(1)陽性結(jié)果：Reptin陽性信號為黃色或者棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，Has2陽性信號呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞間質(zhì)。

(2)高倍鏡下(x400)對每張切片隨機(jī)選擇5個視野，計(jì)數(shù)200個細(xì)胞/視野。結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)為：弱陽性(+)：陽性瘤細(xì)胞占5%-10%，陽性(++)：陽性瘤細(xì)胞占10%-50%，強(qiáng)陽性(+++)：陽性瘤細(xì)胞占>50%，陰性(-)：陽性瘤細(xì)胞占0%-5%。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

見圖1、2。

圖1 Reptin在癌旁肺組織和肺腺癌組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色)

圖2 Has2在癌旁肺組織和肺腺癌組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色)

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Reptin、Has2的表達(dá)情況及與117例肺腺癌病例臨床病理特征的關(guān)系，見表1、2、3。

表1 Reptin、Has2在肺腺癌組織與癌旁肺組織中的表達(dá)情況(例)

表2 Reptin的表達(dá)與Has2表達(dá)的相關(guān)性(例)

表3 Reptin、Has2蛋白表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

3 討論

Reptin (RUVBL2)在轉(zhuǎn)錄過程中作為NuA4組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的組分，通過核小體組蛋白H4和H2A的乙酰化參與基因的轉(zhuǎn)錄，參與癌基因和原癌基因相關(guān)激活誘導(dǎo)、腫瘤抑制基因相關(guān)生長周期控制、細(xì)胞凋亡以及DNA修復(fù)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序[6]。Wood等發(fā)現(xiàn)RUVBL1(Pontin)和RUVBL2在體內(nèi)可與MYC復(fù)合，結(jié)合依賴于對致癌活性必需的MYC結(jié)構(gòu)域，通過LEF1 / TCF1-CTNNB1復(fù)合物調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活，在MYC的致癌轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[7]。另外Venteicher等的發(fā)現(xiàn)Reptin是構(gòu)成HeLa端粒酶復(fù)合物的一種組分[8]。因此，Reptin通過ATP依賴性方式催化雙鏈DNA向單鏈DNA的解旋和作為多種表觀遺傳修飾復(fù)合物的組分，在復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮廣泛作用。

此外，Joaquim和J?rg等人的研究表明Reptin還可通過mTOR 和 TGF-β信號通路影響細(xì)胞生物學(xué)行為[9,10]，且在肝細(xì)胞肝癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌、腮腺癌中扮演重要角色[11-14]，Reptin已在肝細(xì)胞肝癌中作為治療靶點(diǎn)[15]。

而Has2作為一種透明質(zhì)酸合成酶參與透明質(zhì)酸的合成過程，透明質(zhì)酸是大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其在組織結(jié)構(gòu)中具有結(jié)構(gòu)作用并對細(xì)胞粘附，遷移和分化調(diào)節(jié)是必需的。Michael等用IL1B或TGF-β-1處理人腎近端小管上皮細(xì)胞(PTC)后，HAS2和HAS2AS1的表達(dá)均上調(diào)。敲減和過表達(dá)研究顯示IL1B通過SP1/ SP3起作用，并且TGF-β-1通過SMAD2/ SMAD3起作用[16]。Young-Heon和Zhao等人的研究也發(fā)現(xiàn)Has2與TGF-β、PI3K/AKT等信號通路相關(guān)[17,18]。且Has2與乳腺癌、膀胱癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[19-21]，并已作為膀胱癌的診斷標(biāo)志物應(yīng)用于臨床[20]

我們的實(shí)驗(yàn)通過對Reptin、Has2在肺腺癌中表達(dá)位置及臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，兩者表達(dá)存在相關(guān)性且與肺腺癌的分化程度相關(guān)。我們推測Reptin可通過激活癌基因、TGF-β信號通路等方式直接或間接影響Has2基因的表達(dá)，進(jìn)而影響肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，并可作為肺腺癌診斷的生物標(biāo)志物及相關(guān)臨床病理特征評估應(yīng)用。