敖東，劉恩賜，吳瑩瑩，黃曉凌，陳鳳喜

廣東省陽江市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，廣東陽江 529500

遺傳代謝性疾?。↖MD）是由基因突變造成參與體內代謝的運轉蛋白、酶及膜或受體缺陷，使機體發(fā)生代謝紊亂，引起代謝產物蓄積或終末代謝產物缺所致的疾病，種類復雜多樣，危害嚴重，大部分會引起患兒嚴重智力障礙，甚至可能病死[1-3]。目前，IMD已成為新生兒疾病篩查中重要項目之一，早期IMD患兒臨床表現(xiàn)缺乏典型性，診斷難度較大，易出現(xiàn)誤診，直接影響疾病的治療。早期篩查、早期確診、盡早實施對癥治療是確保新生兒健康成長的重要手段。細菌抑制法、酶聯(lián)免疫法、熒光法、時間分辨熒光法等是臨床篩查新生兒IMD的傳統(tǒng)手段，但一次實驗只能檢測一種疾病，篩查效率較低[4-5]。串聯(lián)質譜技術可篩查出氨基酸代謝異常、有機酸代謝異常和脂肪酸代謝異常等疾病，能夠同時檢測至少30種疾病標志物，逐漸被應用于新生兒IMD的篩查中[6-7]。該研究整群選擇2019年7月—2020年12月期間在陽江市婦幼保健院和該市另外18家醫(yī)院統(tǒng)一將標本送至陽江市新生兒疾病篩查中心接受IMD篩查的新生兒12 409例為研究對象，分析串聯(lián)質譜技術在新生兒IMD臨床應用效果，以期為臨床提供參考依據?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

整群選擇在陽江市婦幼保健院和該市另外18家醫(yī)院統(tǒng)一將標本送至陽江市新生兒疾病篩查中心接受IMD篩查的新生兒12 409例為研究對象，出生日齡3～8 d，平均出生日齡（3.61±0.43）d；男7 080例，女5 329例；足月分娩11 846例，早產兒563例。該研究經醫(yī)學倫理委員會審核批準。入組新生兒家長均對該研究知情，自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

①標本采集。所有新生兒均在出生后3 d后接受IMD篩查，且充分哺乳≥6次。按摩或熱敷新生兒足跟，并用75%乙醇消毒皮膚后，待乙醇完全揮發(fā)后，使用一次性采血針刺足跟內或外側，處深度＜3 mm，用干棉球拭去第1滴血，取第2滴血，將Whatman 903標準濾紙片接觸血滴，使血自然滲透至濾紙背面形成血斑，確保濾紙上血斑直徑＞0.8 mm，至少采集3個血斑。血片懸空平置，自然晾干呈深褐色，置入統(tǒng)一專用的標本采集塑料袋內，保存于2～8℃冰箱內，盡快送檢。②串聯(lián)質譜技術檢測：使用美國SCIEX公司的SCIEX API 3200串聯(lián)質譜分析儀測定血斑中的脂肪酸、氨基酸、有機酸等指標及其比值，首先用打孔器將空白濾紙片、高低質控制品和標本打出直徑為3 mm的血斑，置入96孔聚丙烯板孔內，在孔內加入含有氨基酸、?；鈮A同位素內標工作液，每孔100μL，封膜，45℃環(huán)境下，孵育震蕩45 min，650～750 r/min，再提取75μL上清液，置入V型底檢測板內，用鋁膜覆蓋，最用SCIEX API 3200系統(tǒng)檢測。廣州豐華公司提供實驗過程所用質控品和試劑盒，實驗嚴格按儀器、試劑操作說明書篩查。見表1、表2。

表1 各種氨基酸的參考值范圍

表2 各種肉堿的參考值范圍

1.3 可疑病例確診試驗

對串聯(lián)質譜技術篩查初篩陽性者實施生化、血常規(guī)、血氨、血糖、血同型半胱氨酸、丙酮酸、尿有機酸和尿酮體檢測，并實施基因分析和血氣分析，作為進一確診試驗。

1.4 初篩陽性與基因確診

12 409 例新生兒經串聯(lián)質譜技術篩查初篩陽性IMD 352例（2.83%），按陽江市新生兒疾病篩查技術規(guī)范要求，對所有初篩陽性患兒召回重新采血復查一次和進行尿有機酸分析，對復查陽性和尿有機酸異常的患兒進行基因分析，最終確診3例（0.02%）。①高苯丙氨酸血癥（HPA）、基因結果：CDS12；Het錯義突變。②原發(fā)性肉堿缺乏癥（PCD）、基因結果：c.760C＞(p.R254X)。③3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥（MCCD）、基因結果：chr3 exon12 c.1 331 g＞A(p.r444h)雜合突變。

1.5 治療與隨訪

對于確診的3例IMD患兒分別為高苯丙氨酸血癥（HPA）1例、原發(fā)性肉堿缺乏癥（PCD）1例、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥(MCCD)1例。HPA確診后立即給予低血苯丙氨酸（Phe）飲食，選擇低Phe或無Phe的奶粉、面、米等，確保蛋白質、熱量和一定數(shù)量Phe攝入，隨著患兒年齡不斷增長，對食譜及時調整，注意補充微量元素和維生素，定期監(jiān)測血Phe濃度。PCD確診后按照血液游離肉堿(C0)濃度給予左卡尼（國藥準字H20000522）治療，50～200 mg/（kg·d），分次服用，待C0水平恢復正常后維持劑量（終身服藥），避免饑餓。MCCD確診后立即給予生物素（國藥準字H20031188）10～40 mg/d治療，急性期輔助低蛋白質、肉堿攝入等治療。跟蹤隨訪1年，定期影像學檢查、體格發(fā)育檢查和心理發(fā)育檢查等，并密切觀察血液中氨基酸譜等濃度。

1.6觀察指標

分析串聯(lián)質譜技術在新生兒IMD中篩查價值。

1.7 統(tǒng)計方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據，計數(shù)資料以頻數(shù)及百分比表示，組間差異比較以χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

12 409 例新生兒經串聯(lián)質譜技術篩查出高度疑似IMD 352例（2.83%），其中確診3例（0.02%）。3例確診IMD患兒均為足月分娩兒，其中HPA 1例、PCD 1例、MCCD 1例。隨訪1年，3例患兒均因及時確診病情，及時實施相應的治療措施干預，無明顯癥狀。HPA、PCD、MCCD患兒因及時治療，體格、智力發(fā)育正常，因PCD是由SLC22A5基因突變造成肉堿轉運體（OCTN2）蛋白功能缺陷所致，治療的關鍵在于補充C0，而MCCD可以參與生物素代酶缺乏和參與生物素代謝的全羧化酶合成酶缺乏所致，表現(xiàn)為難治性皮膚損害、神經系統(tǒng)損害和代謝性中毒，治療的關鍵在于補充機體生物素水平。 不同季節(jié)、性別、出生體質量、孕周確診IMD率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同季節(jié)、性別、出生體重、孕周確診IMD情況對比[n(%)]

3 討論

IMD是一類主要由氨基酸、有機酸、脂肪酸代謝異常所致的代謝功能缺陷的遺傳病，能誘發(fā)機體重要生物物質缺失、代謝物沉積等，導致患者出現(xiàn)神經系統(tǒng)異常、代謝性酸中毒、酮癥等多種臨床癥狀，多見于兒童時期，病情呈緩慢進行性進展[8-10]。IMD可影響患兒的生長發(fā)育，其中經典的IMD苯丙酮尿癥出生時一般無特異性臨床表現(xiàn)，但出生3個月后患兒會出現(xiàn)生長發(fā)育、智能落后，隨著年齡不斷增長而逐漸加重，病情嚴重時患兒的智商不足50[11-13]。早期準確篩查IMD，明確診斷，實施有效治療措施干預，是規(guī)避小兒發(fā)育不可逆風險的重要手段。因IMD病種較多，常規(guī)使用細菌抑制法、熒光法等檢查一次實驗僅能檢測出一種疾病，工作量大，篩查效率較低，無法滿足臨床需求[14-16]。

串聯(lián)質譜分析中數(shù)據的采集是通過中性粒子丟失、母離子掃描和多反應監(jiān)測3種模式來完成，基本原理是將分析物電離成質荷比不同的帶電離子，將電磁學原理分離離子，并測定離子峰值強度，經與內標液隊徽，定量分析標本中的物質濃度，檢測水平能達到pg級，可在短時間內通過一種檢測篩查出多種疾病，具有檢測效率高、操作簡單方便、所需樣本量微小、準確率高等優(yōu)點[17-18]。該研究中，12 409例新生兒經串聯(lián)質譜技術篩查出高度疑似IMD 352例（2.83%），其中確診3例（0.02%），均為足月分娩兒，其中HPA 1例、PCD 1例、MCCD 1例。隨訪1年，3例患兒均因及時確診病情，及時實施相應的治療措施干預，無明顯癥狀，不同季節(jié)、性別、出生體質量、孕周確診IMD率比較差異無統(tǒng)計學意義，提示串聯(lián)質譜技術能有效篩查出新生兒IMD，指導臨床盡早治療。因IMD是由機體部分受體或膜、酶等生物合成過程中出現(xiàn)遺傳缺陷，造成體液、細胞中的毒性中間代謝產物大量聚集或必須代謝產物缺乏，引起氨基酸、乙酰肉堿等代謝產物增高。串聯(lián)質譜技術通過干血濾紙片分析氨基酸、乙酰肉堿等，能篩查出脂肪酸代謝紊亂、氨基酸代謝紊亂、有機酸代謝紊亂等在內的共40余種IMD，臨床應用價值較高[19-21]。但串聯(lián)質譜技術檢測結果可能會受到新生兒出生體質量、胎齡、采血時間等影響，存在一定的假陽性率，儀器價格昂貴且保養(yǎng)、操作費用相對較高，在基層醫(yī)院推廣受到一定的限制。周偉等[22]對徐州地區(qū)新生兒遺傳代謝疾病篩查顯示，165 262例新生兒中篩查可疑陽性例數(shù)為3 344例，召回率為91.23%，其中確診IMD 94例（0.06%），包含12例原發(fā)性肉堿吸收障礙，5例母源性肉堿吸收障礙，12例甲基丙二酸血癥，1例戊二酸血癥Ⅰ型，2例戊二酸血癥Ⅱ型，52例苯丙酮尿癥，其他11例。該研究中，陽江地區(qū)的IMD發(fā)病率與上述統(tǒng)計結果相比相對較低，這可能與陽江地區(qū)區(qū)域性有關（陽江是廣東省經濟欠發(fā)達地區(qū)，多年來外來人口少，該研究的12 409例新生兒父母雙親絕大多數(shù)都是當?shù)鼐用瘢?9間分娩醫(yī)院覆蓋了陽江市各個區(qū)、縣）。該研究因研究時間和精力有限，結果仍存在一定的不足之處，如未與他人研究結果相對比、隨訪時間較短等，后期仍需加大樣本量深入研究。

綜上所述，早期行串聯(lián)質譜技術檢測能有效篩查出IMD，指導臨床治療，對于提高新生兒生存質量具有重大意義。