周華書(shū)

(周寧縣水產(chǎn)技術(shù)站，福建 寧德 355400)

腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)是一種革蘭氏陽(yáng)性、凝固酶陰性、非溶血性球菌[1-2]。腐生葡萄球菌廣泛存在于自然環(huán)境中，目前已報(bào)道該菌株可從女性生殖道、奶牛、腌肉制品、人胃腸道等中被分離鑒定。近年來(lái)，腐生葡萄球菌已成為動(dòng)物源感染的常見(jiàn)病原菌[3-4]，隨著抗生素的大量使用甚至濫用，導(dǎo)致腐生葡萄球菌具有多重耐藥的趨勢(shì)[5]。但關(guān)于從鱘魚(yú)病料中分離到腐生葡萄球菌的研究卻鮮有報(bào)道。另外，腐敗葡萄球菌作為水產(chǎn)品的特定腐敗菌[6]，能夠迅速繁殖并產(chǎn)生具有腐敗臭味代謝產(chǎn)物的菌群[7]，極大地影響了水產(chǎn)品的品質(zhì)、貯藏貨架期。細(xì)菌全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，為研究腐生葡萄球菌的進(jìn)化關(guān)系提供了分子水平的依據(jù)，并在葡萄球菌耐藥性及致病因子、相關(guān)疫情暴發(fā)的檢測(cè)和鑒定等方面均具有重要意義[8]。

2021年3月周寧縣某史氏鱘養(yǎng)殖場(chǎng)的史氏鱘(Acipenserschrenckii)出現(xiàn)腐皮、潰瘍等癥狀，而且有死亡病例。本研究從史氏鱘潰瘍病灶處分離到1株革蘭氏陽(yáng)性菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，研究了其耐藥特性，旨在為該菌的后續(xù)研究提供指導(dǎo)，為該菌可能引起的疾病防治提供科學(xué)資料。同時(shí)采用高通量測(cè)序平臺(tái)從全基因組序列層面分析菌株JY08的進(jìn)化地位、毒力因子和耐藥基因，為進(jìn)一步評(píng)估該菌株基因組特征提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來(lái)源和主要試劑

發(fā)病的史氏鱘來(lái)源于福建省周寧縣某史氏鱘養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為550～700 g，體長(zhǎng)為55 cm左右。將病料放入白色的搪瓷盤(pán)中，可見(jiàn)腐皮及皮膚潰瘍等癥狀。

腦心浸液(BectoTMBrain heart infusion,BHI)購(gòu)自BD公司；TSB、LB液體培養(yǎng)基，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(5%脫脂綿羊血)購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。API 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(型號(hào)：VITEK 2 COMPACT 30)及相關(guān)試劑購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。試驗(yàn)中所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 菌株的分離和培養(yǎng)

選取具有腐皮的典型癥狀史氏鱘病例，用75%的酒精對(duì)病魚(yú)進(jìn)行體表消毒，無(wú)菌取其腹部潰瘍組織經(jīng)勻漿粉碎后涂布于BHI、TSB、LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察生長(zhǎng)的菌落，并挑取平板上形態(tài)顏色一致的菌落，在相同條件下進(jìn)一步劃線純化培養(yǎng)，最后轉(zhuǎn)移到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，于16%的甘油中(-80℃)保存待用，菌株編號(hào)為JY08。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征試驗(yàn)

將菌株JY08接種于TSA瓊脂培養(yǎng)基平板及哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(5%脫脂綿羊血)平板，30℃培養(yǎng)18 h后觀察菌落的大小、形態(tài)、顏色及溶血現(xiàn)象等，利用透射電子顯微鏡觀察其超微形態(tài)結(jié)構(gòu)。挑取BHI瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落置于載玻片上，經(jīng)革蘭氏染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。用無(wú)菌棉簽蘸取適量JY08單菌落于生理鹽水中，充分搖勻后使用濁度儀配制0.50～0.63 McF的菌懸液，將混合液加入GPN鑒定卡中，將鑒定卡放于API全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀中培養(yǎng)，鑒定儀自動(dòng)讀取生理生化鑒定結(jié)果。

1.4 抗生素敏感試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)檢測(cè)菌株JY08對(duì)30種藥敏紙片的敏感性，每種藥物設(shè)3個(gè)重復(fù)。30℃培養(yǎng)24 h后觀察，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，取抑菌圈直徑平均值，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所出版的藥敏試驗(yàn)指南的標(biāo)準(zhǔn)判定菌株對(duì)不同藥物的敏感性。質(zhì)控菌株為大腸桿菌(ATCC25922)。

1.5 16S rRNA基因序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取菌株JY08基因組DNA，以此為模板利用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16S rRNA基因序列，上游引物27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化，由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司(福州測(cè)序部)測(cè)序。

將序列提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行16S rRNA基因序列相似性分析。從EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中提取與菌株JY08同源性較高菌株的16S rRNA基因序列，并從中選取16個(gè)與該株菌最相似菌株的16S rRNA基因序列，利用Clustal W進(jìn)行比對(duì)，用MEGA7軟件包中的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)1 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

1.6 基因組草圖測(cè)序及分析

利用瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop檢測(cè)和Qubit檢測(cè)上述菌株JY08基因組DNA的質(zhì)量，將純化的基因組DNA經(jīng)Covaris破碎儀隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度為350 bp小片段，經(jīng)末端修復(fù)和加A尾后在片段兩端連接接頭制備 DNA文庫(kù)。

庫(kù)檢合格后，利用Illumina NovaSeq PE150測(cè)序平臺(tái)對(duì)菌株JY08 DNA文庫(kù)進(jìn)行基因組測(cè)序。數(shù)據(jù)下機(jī)后經(jīng)過(guò)預(yù)處理后得到 clean data，使用 SOAP denovo(Version 2.04)、SPAdes、ABySS組裝軟件進(jìn)行組裝，并最終使用CISA軟件進(jìn)行整合；采用gapclose(Version：1.12)優(yōu)化整合組裝結(jié)果，同時(shí)過(guò)濾掉 500 bp以下(污染)的片段，從而獲得最終的組裝結(jié)果。使用GeneMarkS(Version 4.17)軟件預(yù)測(cè)編碼基因。采用毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB)和抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Comprehensive Antibiotic Research Database，CARD)對(duì)菌株的基因組中所包含的毒力基因和耐藥基因進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征

從腐皮及皮膚潰瘍等癥狀的病魚(yú)組織中分離到一株細(xì)菌，命名為JY08。該菌革蘭氏染色為陰性；在BHI、TSB和LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(5%脫脂綿羊血)經(jīng)過(guò)30℃培養(yǎng)24 h后形成大小約為0.3～0.5 cm、光滑、濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊、不透明、白色菌落，不產(chǎn)生溶血圈；透射電子顯微鏡觀察可見(jiàn)，菌株JY08約為0.5 μm的球形(圖1)。

API 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定結(jié)果(表1)顯示，菌株JY08為腐生葡萄球菌，檢測(cè)結(jié)果的置信度高，為98%。菌株JY08能發(fā)酵D-核糖、D-麥芽糖、D-甘露糖、蔗糖和D-海藻糖；精氨酸雙水解酶1、α-葡萄糖苷酶、焦谷氨酸芳胺酶和尿素酶試驗(yàn)為陽(yáng)性；能夠在6.5% NaCl培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

表1 菌株JY08生理生化特征

續(xù)表1

2.2 菌株JY08藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株JY08對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、磺胺類(lèi)和林可霉素類(lèi)等17種抗生素具有完全耐藥性；對(duì)氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和氯霉素類(lèi)等11種藥物敏感；對(duì)多粘菌素B和呋喃唑酮2種藥物中度敏感(表2)。

表2 菌株JY08藥物敏感結(jié)果

續(xù)表2

2.3 16Sr RNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

以菌株JY08的基因組DNA為模板，利用通用引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到16S rRNA基因產(chǎn)物，測(cè)序結(jié)果顯示該基因?yàn)? 541 bp。將該序列提交到EzBioCloud(https：//www.ezbiocloud.net/)進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析，結(jié)果顯示，菌株JY08的16S rRNA基因序列與腐生葡萄球菌腐生亞種(Staphylococcussaprophyticussubsp.saprophyticus)相似度最高，為100%?；?6S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，菌株JY08與腐生葡萄球菌腐生亞種(Staphylococcussaprophyticussubsp.saprophyticusATCC 15305)聚集到一個(gè)發(fā)育支(圖2)。進(jìn)一步表明菌株JY08屬于葡萄球菌屬，與腐生葡萄球菌腐生亞種具有較近的親緣關(guān)系。

2.4 菌株JY08基因組測(cè)序結(jié)果

菌株JY08經(jīng)Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行基因組測(cè)序后，共得到1 089 M bp clean data，通過(guò)對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行組裝，最終獲得20個(gè)contig，組裝的contigs總長(zhǎng)度為2 666 340 bp，N50為 366 095，測(cè)序平均覆蓋深度408×，基因組質(zhì)量滿(mǎn)足后續(xù)生物信息學(xué)分析?；蚪M鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶(GC)含量為33.01%，對(duì)基因組編碼基因預(yù)測(cè)，注釋得到的基因總數(shù)為2 672個(gè)(圖3)。

2.5 菌株JY08耐藥基因分析

通過(guò)對(duì)染色體基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株JY08攜帶了多種類(lèi)型的抗生素耐藥基因，包括10大類(lèi)103個(gè)抗生素耐藥基因。從表3中可知，外排泵系統(tǒng)基因數(shù)量最多，主要包括macB(8個(gè))、patA(6個(gè))和lmrB(5個(gè))等71個(gè)耐藥基因。其次為介導(dǎo)糖肽類(lèi)抗生素(萬(wàn)古霉素)耐藥的vanRC/I/M/F/I等13個(gè)耐藥基因，其余為介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、多肽類(lèi)抗生素(多粘菌素)、四環(huán)素類(lèi)抗生素(四環(huán)素)、喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)和二氨基嘧啶類(lèi)等抗生素耐藥的基因。

表3 菌株JY08中耐藥基因分析結(jié)果

2.6 菌株JY08中毒力因子分析

經(jīng)VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株JY08共攜帶了61種毒力因子及123個(gè)相關(guān)毒力基因，其中與細(xì)菌黏附功能相關(guān)的毒力因子有26個(gè)包含49個(gè)基因；與胞外酶相關(guān)的毒力因子有15個(gè)包含20個(gè)基因；與宿主免疫逃逸相關(guān)的毒力因子有3個(gè)包含25個(gè)基因；與分泌系統(tǒng)相關(guān)的毒力因子有7個(gè)包含10個(gè)基因；與毒素相關(guān)的毒力因子有4個(gè)包含5個(gè)基因；與鐵攝取相關(guān)的毒力因子有6個(gè)包含14個(gè)基因(表4)。

表4 菌株JY08的毒力因子檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表4

續(xù)表4

3 討論

腐生葡萄球菌在自然界中廣泛存在，具有豐富的生物學(xué)功能。目前，已分別從羊[9]、雞肉[10]、腐敗鯧魚(yú)[11]、土壤[12]中分離鑒定出腐生葡萄球菌。劉力等[13]從白腐乳中分離出一株腐生葡萄球菌ZH910，接種至白腐乳發(fā)酵體系中，可賦予白腐乳優(yōu)良的風(fēng)味并明顯加快產(chǎn)香速度。熊晶晶等[14]從舟山雙峰鹽場(chǎng)的鹽田中分離篩選到一株對(duì)孔雀石綠具有較強(qiáng)脫色能力的腐生葡萄球菌JJ-1，孔雀石綠的主要降解產(chǎn)物為4-(二甲氨基)二苯甲酮。本研究從養(yǎng)殖的史氏鱘皮膚潰瘍病灶處分離鑒定出腐生葡萄球菌菌株JY08。該菌株能發(fā)酵乳糖和D-甘露醇，不能發(fā)酵D-甘露糖，從而可以把其與向益等[9]從羊分離的腐生葡萄球菌QJ-01區(qū)分開(kāi)，同時(shí)也表明菌株JY08可能具有特異的性質(zhì)。

耐藥基因在各物種間廣泛傳播，使細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性，研究細(xì)菌的耐藥基因有助于理解耐藥表型與基因型的關(guān)系，并為臨床藥物的使用提供參考。有研究檢測(cè)到36株人源腐生葡萄球菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物(慶大霉素等)敏感率為100%[15]，對(duì)苯唑西林、青霉素、慶大霉素耐藥[16-17]。耐藥試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株JY08對(duì)10大類(lèi)抗生素中的4種具有耐藥性，但不對(duì)慶大霉素耐藥。根據(jù)多重耐藥定義，即對(duì)三種或三種以上抗菌類(lèi)中的至少一種藥物產(chǎn)生獲得性耐藥，因此菌株JY08為多重耐藥菌，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[9，18]結(jié)果不一致，可能是菌株分離源不同或者與該養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)一些抗生素使用情況有關(guān)。通過(guò)全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該菌攜帶多種類(lèi)型的抗生素耐藥基因，并以外排泵基因?yàn)橹鳎砻魍馀疟孟到y(tǒng)可能為腐生葡萄球菌JY08產(chǎn)生耐藥性的主要因素。此外，研究發(fā)現(xiàn)15個(gè)基因與糖肽類(lèi)和多肽類(lèi)抗生素抗性相關(guān)，但在藥敏試驗(yàn)中，菌株對(duì)這兩類(lèi)抗生素敏感，表明這些基因可能不完整或者沒(méi)有表達(dá)。與藥敏試驗(yàn)對(duì)應(yīng)，基因組中未發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類(lèi)抗生素抗性基因；此外，本研究發(fā)現(xiàn)磷霉素類(lèi)、夫西地酸和二氨基嘧啶類(lèi)等抗生素的耐藥基因，提示在生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中應(yīng)避免這些藥物的使用[19]。

近年來(lái)隨著人們對(duì)于各種毒力因子的逐步了解，一些毒力因子的致病機(jī)理也逐漸被揭示出來(lái)。通過(guò)與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)腐生葡萄球菌JY08攜帶了大量毒力因子及相關(guān)毒力基因。例如屬于免疫逃避類(lèi)毒力因子的莢膜及莢膜多糖是一種廣泛存在于細(xì)菌、支原體、部分真菌等菌體表面的碳水化合物；莢膜多糖有助于菌體抵抗干燥和低溫等不利環(huán)境，并通過(guò)在菌體表面形成物理屏障阻礙宿主補(bǔ)體的殺傷與吞噬作用；在長(zhǎng)期多種應(yīng)激-壓力環(huán)境下，病原菌已進(jìn)化出多種免疫逃避機(jī)制并促進(jìn)宿主感染[19]。此外，細(xì)菌毒素類(lèi)包含多種溶血素，其中溶血素毒力基因hlyA具有廣譜殺細(xì)胞作用，可作用于紅細(xì)胞、腎臟上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。Den Reijer P M等[21]研究表明溶血素在金黃色葡萄球菌生物膜形成等致病過(guò)程中也起著重要作用，增加了金黃色葡萄球菌的危害性。編碼LPS和Fibronectin-binding protein毒力因子的基因數(shù)量較多，這些吸附類(lèi)毒力因子有助于病原菌定植，形成生物膜，建立自身微生態(tài)環(huán)境。

綜上所述，本研究對(duì)從史氏鱘源分離到的菌株JY08進(jìn)行了常規(guī)鑒定及生物學(xué)特性分析，確定該菌為腐生葡萄球菌。該菌株對(duì)10大類(lèi)抗生素中的4種完全耐藥，為多重耐藥菌。首次通過(guò)基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)史氏鱘源腐生葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，研究了其中的毒力因子及耐藥基因情況，較為全面地預(yù)測(cè)史氏鱘源腐生葡萄球菌耐藥基因、耐藥譜、毒力因子及相關(guān)毒力基因等重要致病特性。研究結(jié)果為今后詳細(xì)探究腐生葡萄球菌JY08的致病機(jī)制、流行規(guī)律和進(jìn)化變異等方面提供了借鑒依據(jù)。