周星貝，丁濤，王樹水

1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）廣東省心血管病研究所心兒科，廣東廣州510080

前言

肝素是使用最廣泛的臨床抗凝藥物之一，肝素的治療窗較窄，對不同人群的抗凝效果存在3～6倍的差異，半衰期存在4 倍差異［1］，因此在使用過程中需要格外關(guān)注藥物濃度變化。在需要拮抗肝素時，如心臟外科手術(shù)術(shù)后，常應(yīng)用魚精蛋白對肝素進(jìn)行中和［2］。魚精蛋白可與肝素形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而拮抗肝素的抗凝效果。但過量的魚精蛋白同樣會造成抗凝，因此魚精蛋白的精準(zhǔn)用藥也需要關(guān)注［3］?？筙a 因子是肝素測量的金標(biāo)準(zhǔn)，直接測量血液中的肝素，結(jié)果不受采血量與采血管中抗凝藥物的比例、患者自身凝血因子水平等因素的影響［4］。由于血液中的紅細(xì)胞、血小板等成分會影響測量結(jié)果［5］，大部分實(shí)驗(yàn)室常用的處理方法是在獲取血液后，對血樣進(jìn)行抗凝、離心，分離出血液中的固體成分，只保留血漿，再對血漿進(jìn)行抗Xa 因子檢驗(yàn)［6-7］。分離血漿這一步驟耗時耗力，加上全血樣品運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室的時間，通常在采血后需要經(jīng)過數(shù)小時的時間才能獲得結(jié)果。而很多臨床場景下，要求臨床醫(yī)生實(shí)時關(guān)注患者的凝血狀態(tài)。因此，縮短血樣的處理時間是保證肝素監(jiān)測結(jié)果時效性的關(guān)鍵［8］。

微透析是一種新型的動態(tài)采樣技術(shù)，它利用高分子膜的半透性，可以將肝素等小分子物質(zhì)從血液中分離，而將血細(xì)胞、血小板等大分子物質(zhì)留在血管內(nèi)，以此避免對血液進(jìn)行離心操作，節(jié)省檢測時間［9-10］。微流控是一種僅需要微量體積的樣品就可以完成對多種生化組分進(jìn)行準(zhǔn)確、快速和大信息量檢測的新型分析手段，通過連續(xù)注射樣品及試劑，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時、快速的生化分析［11-13］。微流控芯片通常長寬僅數(shù)厘米，芯片的設(shè)計(jì)可以根據(jù)實(shí)際需求任意改變［14］。試劑可在芯片流道中完成樣品預(yù)處理、試劑反應(yīng)和結(jié)果檢測等步驟，大大縮短了檢測過程中的時間，節(jié)省了人力。微透析探針的采樣速率通常為1～100 μL/min；微流控芯片可對微升級的樣品進(jìn)行實(shí)時測量，正好與微透析取樣的速率配合［15］。因此，本研究將這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，用于實(shí)時監(jiān)測肝素的濃度變化及魚精蛋白中和肝素的效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

所有化學(xué)品的純度規(guī)格均為分析純級。肝素鈉注射液（常州千紅）、凝血因子Xa（法國, Hyphen Biomed），使用超純水配置濃度為15 μg/mL 的溶液，Xa 因子特異性熒光底物（瑞士,Pentapharm），使用超純水稀釋至0.5 mmol/L，凍干人血漿（法國, Hyphen BioMed），每次使用前依說明書向每分裝瓶中加入3 mL超純水，振蕩溶解，靜置30 min 后使用。上述所有溶液均貯存在4 ℃冰箱。PBS 緩沖液（10×）（美國,Sigma-Aldrich），用超純水按水：儲存液體積比=9：1的比例稀釋成濃度為1×的PBS 溶液、超純水（18.2 mΩ?cm）由Direct-Q系統(tǒng)（法國,Millipore）凈化并使用0.22 μm過濾器過濾（法國,Millipore）后得到。

3000kDa 微透析探針（瑞典,Microbiotech）、微量注射泵（Pump 11 Elite, 美國, Harvard Apparatus）、蠕動泵（美國, Instech）、酶標(biāo)儀（Cytation 5, 美國,Biotek）、熒光顯微鏡（Image.M2,德國,Zeiss）、熒光圖像處理軟件Zen（德國,Zeiss）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微透析探針的回收率測量在燒杯中注入濃度為1 IU/mL 的肝素溶液，底部墊加熱板，使用磁珠攪拌，使肝素溶液始終保持在37 ℃。燒杯開口用封口膜覆蓋避免水分蒸發(fā)影響肝素在溶液中的濃度。將微透析探針的半透膜完全浸沒于肝素溶液中。探針進(jìn)液口接注射泵，持續(xù)輸入透析液（即1×PBS），流速分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μL/min。探針出液口接蠕動泵，持續(xù)向外抽吸透析樣品，抽吸速度與透析液注入流速一致。每次開始收集樣品前，微透析系統(tǒng)先平衡30 min，每次采樣持續(xù)1 h。分別采集微透析探針在不同透析液流速下得到的透析樣品。用傳統(tǒng)的抗Xa因子法，即使用酶標(biāo)儀，定量分析透析樣品中的肝素濃度，計(jì)算微透析探針在不同透析液流速條件下對肝素的回收率。實(shí)驗(yàn)分別使用相同規(guī)格的3組探針進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 微流控芯片的校準(zhǔn)本實(shí)驗(yàn)使用微流控芯片對血漿肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 IU/mL）進(jìn)行測量。微流控芯片的示意圖見圖1。芯片左側(cè)有3個流道入口，入口1：肝素標(biāo)準(zhǔn)液；入口2：Xa因子溶液；入口3：熒光底物。以1.0 μL/min的流速向芯片中注入肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.5 μL/min 的流速向芯片中注入Xa因子溶液與熒光底物。使用熒光檢測儀對觀測點(diǎn)位置進(jìn)行測量，激發(fā)光波長350 nm、發(fā)射光波長450 nm。每隔30 s 讀數(shù)一次，單次檢測持續(xù)5 min。檢測完成后，所有液體從芯片右側(cè)的出口排出。記錄熒光強(qiáng)度值-肝素濃度的曲線，并計(jì)算擬合直線方程，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)依據(jù)熒光強(qiáng)度值計(jì)算肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，同時記錄從更換不同濃度肝素的血漿到觀測發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度值改變所消耗的時間，即系統(tǒng)的反應(yīng)時間。

圖1 微流控芯片示意圖Fig.1 Schematic diagram of microfluidics chip

1.2.3 微透析-微流控系統(tǒng)的性能評價實(shí)驗(yàn)裝置如圖2所示。本實(shí)驗(yàn)將微透析探針浸沒于5 mL 人血漿中，啟動注射泵，以1.0 μL/min 的流速向探針注入透析液。同時啟動蠕動泵以相同的速率在探針出口端抽吸樣品。微透析探針的出口直接與微流控芯片的進(jìn)樣品口連接。以0.5 μL/min 的流速向芯片中注入Xa 因子溶液與熒光底物。啟動熒光檢測儀，對芯片觀測點(diǎn)位置的熒光進(jìn)行觀測，每30 s 讀數(shù)一次，并記錄測量到的熒光強(qiáng)度值，按回收率及標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出對應(yīng)的肝素濃度。穩(wěn)定運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)30 min 后，在10 min 內(nèi)緩慢添加肝素，直至被測血漿中的濃度升高至4 IU/min。5 min 后，向血漿中每隔5 min 注入一次0.05 mg 魚精蛋白，中和肝素直至血漿中的肝素濃度降低為0 IU/mL。在應(yīng)用微透析-微流控系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測的同時，每隔5 min 從血漿中取樣，使用傳統(tǒng)的酶標(biāo)儀法對肝素濃度進(jìn)行測量。

圖2 微透析-微流控裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of microdialysis-microfluidics system

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

多組重復(fù)實(shí)驗(yàn)后計(jì)算各結(jié)果的算術(shù)平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)誤。在計(jì)算熒光強(qiáng)度-肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線時，首先使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)判斷二者是否線性相關(guān)。若兩者線性相關(guān)性顯著，則使用SPSS 軟件進(jìn)行線性回歸，得到擬合直線方程即標(biāo)準(zhǔn)直線方程；若線性相關(guān)不顯著，則根據(jù)具體的曲線關(guān)系，建立對應(yīng)的非線性回歸方程。在分析微透析-微流控系統(tǒng)與傳統(tǒng)的酶標(biāo)儀結(jié)果的一致性時，使用SPSS 計(jì)算兩組結(jié)果的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)。如果組內(nèi)相關(guān)系數(shù)值<0.4，認(rèn)為兩種方法獲得的結(jié)果一致性較差；如果組內(nèi)相關(guān)系數(shù)值>0.75，認(rèn)為兩種方法獲得的結(jié)果一致性高。

2 結(jié)果

2.1 微透析探針回收率測量

不同透析液流速下的微透析探針回收率見圖3。結(jié)果顯示，探針在透析液流速分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μL/min 時，平均回收率分別為47.0%、38.9%、26.8%、13.2%、4.8%，透析液流速越慢，探針的回收率也越高。但隨著流速的降低，樣品流過探針管道的時間增加，系統(tǒng)的延遲時間也隨之增加，使得透析的延遲時間變長，時效性降低。為了在保證微透析時效性的基礎(chǔ)上最大限度地獲得更高的回收率，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用1.0 μL/min 作為透析液的流速進(jìn)行微透析。此時微透析探針的回收率為（38.9±2.8）%。

圖3 不同透析液流速下的微透析探針回收率Fig.3 Rate of recovery of microdialysis probe at different dialysate flow rates

2.2 微流控芯片的校準(zhǔn)

使用微流控芯片對肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測量的結(jié)果見圖4。隨著肝素濃度的升高，芯片觀測點(diǎn)位置的熒光強(qiáng)度值逐漸降低。當(dāng)肝素濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 IU/mL時，熒光強(qiáng)度均值分別為15 111.3、13 338.3、11 635.2、10 090.5、8 296.0、6 550.3。計(jì)算熒光強(qiáng)度均值與肝素濃度的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.999 8（P<0.05），表明兩者線性相關(guān)性顯著。使用SPSS軟件進(jìn)行線性回歸，得到擬合直線方程為：y=-1 699.3x+15 085R2=0.999 6。本實(shí)驗(yàn)還記錄了從更換被測溶液到系統(tǒng)監(jiān)測到熒光強(qiáng)度變化所用的時長為16 min，即系統(tǒng)的響應(yīng)時間為16 min。

圖4 使用微流控芯片測量肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得的肝素-熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Heparin-fluorescence standard curves generated by measuring heparin standard solution using microfluidics chip

2.3 微透析-微流控系統(tǒng)的性能評價

使用微透析-微流控系統(tǒng)及酶標(biāo)儀對5 mL 人血漿中的肝素濃度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，結(jié)果見圖5。在注入肝素后，通過微透析-微流控系統(tǒng)可以觀察到肝素的濃度逐漸上升，在第13分鐘時達(dá)到最高值，即4.0 IU/mL。首次加入0.05 mg 魚精蛋白后，肝素濃度降低至2.9 IU/mL。補(bǔ)加魚精蛋白后，肝素濃度降低至1.9 IU/mL。第4 次加入魚精蛋白后，肝素被完全中和，濃度降低至0 IU/mL。此時共注射魚精蛋白0.2 mg，與血漿中肝素含量的比值為1 mg 魚精蛋白：100 IU 肝素。采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)法分析微透析-微流控系統(tǒng)與傳統(tǒng)酶標(biāo)儀法測量結(jié)果的一致性，得到組內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.995（P<0.05），可認(rèn)為兩種測量方法得到的結(jié)果一致性高。

圖5 使用微透析-微流控系統(tǒng)對人血漿中的肝素濃度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測Fig.5 Real-time monitoring of heparin concentration in human plasma using microdialysis-microfluidics system

3 討論

為了實(shí)現(xiàn)肝素的實(shí)時監(jiān)測，本研究研制了基于微透析和微流控的實(shí)時檢驗(yàn)裝置。微透析半透膜的孔徑大小通常由分子橫截量來描述，半透膜橫截量越大，對物質(zhì)的回收率越高［16］。但微孔的尺寸大，可能導(dǎo)致透析液外漏，獲得的樣品體積減少。有研究采用增加透析液膠體滲透壓的方法，一定程度上減少了透析液損失，使采樣量達(dá)到透析液注入量的76%［17］。針對這一問題，本研究在探針的出口端外接了一個蠕動泵，使用與透析液注射速率相同的速度對探針內(nèi)的液體進(jìn)行抽吸，平衡因注入透析液造成的半透膜內(nèi)外壓差，避免透析液外滲［17］，采樣量可達(dá)透析液注入量的100%。

微流控芯片的設(shè)計(jì)是實(shí)現(xiàn)肝素檢測功能的重要環(huán)節(jié)。肝素會抑制Xa因子的活性，進(jìn)而抑制Xa因子對熒光底物的作用，實(shí)現(xiàn)肝素濃度轉(zhuǎn)化光學(xué)信號的過程［18］。芯片設(shè)計(jì)將肝素樣品先與Xa 因子混合，然后再向該混合物中引入熒光底物。樣品與試劑的混合順序可直接影響芯片測量的準(zhǔn)確性。用于分析其他藥物的微流控芯片通常將多種試劑同時與被測樣品混合反應(yīng)［19］，但在本實(shí)驗(yàn)中，如果將3 種液體同時混合，Xa 因子會同時分別與肝素和熒光底物反應(yīng)。此時本應(yīng)該被肝素抑制、但尚未與肝素接觸的Xa 因子提前與熒光底物接觸，而熒光底物激活的反應(yīng)過程不可逆。這種情況下，芯片中觀測到的熒光會高于實(shí)際的強(qiáng)度值，為測量帶來誤差。因此，本實(shí)驗(yàn)選用先將肝素、Xa因子充分反應(yīng)混合后，再引入熒光試劑的設(shè)計(jì)，保證肝素測量的準(zhǔn)確性。此外，微流道的設(shè)計(jì)中還加入了S型的流道，保證流道中液體的有效接觸、完全反應(yīng)。

通過向血漿中加入肝素，模擬患者注射肝素后血藥濃度上升的過程，再加入魚精蛋白中和肝素，使用微透析-微流控系統(tǒng)對整個過程進(jìn)行監(jiān)測。魚精蛋白能與肝素結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，阻止肝素與Xa因子反應(yīng)，從而拮抗肝素的抗凝作用［20］。目前臨床常用計(jì)算魚精蛋白用量的方法為魚精蛋白滴定法，需要將患者的全血樣品分別與不同濃度的魚精蛋白混合。若魚精蛋白濃度不足，殘留的肝素會抑制凝血，而過量的魚精蛋白同樣有抗凝效果［3］。因此可根據(jù)最早出現(xiàn)凝血的實(shí)驗(yàn)組魚精蛋白的濃度估算最佳的魚精蛋白用藥量［21］。魚精蛋白滴定法測量肝素的精度取決于實(shí)驗(yàn)組間的魚精蛋白梯度差。臨床通常采用6 個魚精蛋白濃度，梯度為0.7 IU/mL。測量結(jié)果較真實(shí)水平有0.1～0.3 IU/mL 的波動，按照體外循環(huán)的肝素濃度為3～4 IU/mL 計(jì)算，最大可能會有10%的誤差，無法保證用藥的安全性［3］。

本研究闡述的微透析-微流控系統(tǒng)可對肝素濃度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，使用者可直觀地觀察肝素濃度的變化，及時調(diào)整肝素與魚精蛋白的給藥方案，減少臨床不良事件的發(fā)生。該系統(tǒng)測得的肝素濃度與傳統(tǒng)酶標(biāo)儀方法測得的結(jié)果一致性高，組內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.995（P<0.05），證明了該系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究將微透析與微流控技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，為血液中肝素濃度的在線、實(shí)時監(jiān)測提供可行的方案。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微透析探針可對血漿中的肝素有效采樣；微流控芯片配合熒光試劑，能夠可持續(xù)地精確測量出樣品中的肝素變化，并得到清晰的藥物濃度曲線。該微透析-微流控系統(tǒng)能顯著提高肝素檢測的時效性，將以往需要數(shù)小時的檢測時長縮短至16 min，可精確測量0～4 IU/mL 的肝素濃度。同時，該系統(tǒng)還具有良好的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)一種新型的肝素快速分析和魚精蛋白效果評價的方法，為臨床用藥提供更清晰的視野。