李旭綱，陳一心,2，邱旭升,2

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210008；2.南京鼓樓醫(yī)院骨科，江蘇南京210008

前言

感染性骨不連一直是骨科臨床治療的棘手問(wèn)題，其治療目標(biāo)是消除感染、促進(jìn)骨折愈合，手術(shù)治療是目前唯一有效的治療方法。雖然近年來(lái)由于優(yōu)良的內(nèi)固定材料及手術(shù)方法的改進(jìn)，感染性骨不連的治療效果有了很大的改善，但其花費(fèi)高且術(shù)后仍存在感染復(fù)發(fā)、骨折不愈合的風(fēng)險(xiǎn)［1］。因此，尋找一種無(wú)創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)且有效的治療方法十分必要。脈沖電磁場(chǎng)（Pulsed Electromagnetic Field, PEMF）用于骨不連的治療已有40多年，其可以控制破骨細(xì)胞的形成，刺激人骨髓基質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,從而加快骨不連愈合［2-4］。如果PEMF 同時(shí)具有抑菌或殺菌作用，那便為感染性骨不連的治療提供新的思路。近年來(lái)，應(yīng)用各種物理磁學(xué)抑菌的報(bào)道不少，其中包括極低頻電磁場(chǎng)、旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)、靜磁場(chǎng)等等［5-7］。Del Re等［6］研究發(fā)現(xiàn)極低頻電磁場(chǎng)的暴露使得大腸桿菌內(nèi)熱休克蛋白增多，從而促使細(xì)菌凋亡；Fojt 等［8］認(rèn)為電磁場(chǎng)可能對(duì)細(xì)胞膜中離子通道滲透性產(chǎn)生影響，從而影響離子進(jìn)入細(xì)胞的運(yùn)輸，從而導(dǎo)致生物體內(nèi)的生物變化，另一個(gè)可能的影響是由于磁場(chǎng)暴露而形成自由基［9］。而對(duì)于低能低強(qiáng)度PEMF 對(duì)細(xì)菌的作用，尚沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究選用骨科感染常見(jiàn)致病菌金黃色葡萄球作為研究對(duì)象，研究PEMF對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響及其與抗生素之間的協(xié)同作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌（ATCC 29213），來(lái)自南京鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科。

1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（南京便診生物科技有限公司）；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（江門(mén)市凱林貿(mào)易有限公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

骨生長(zhǎng)刺激儀（荷蘭IMD.B.V 公司，Orthopulse?Bone Growth Stimulator，能產(chǎn)生場(chǎng)強(qiáng)1 Gs、頻率15 Hz、脈寬5 μs、脈沖群寬5 ms、脈沖群不應(yīng)期62 ms的PEMF）；DENSICHECK比濁儀（法國(guó)生物梅埃利公司）；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液制配

采用接種環(huán)選取單個(gè)直徑約2 mm的標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌菌株菌落，使用平板劃線接種法接種至新的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，置入37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h。隔天取出血瓊脂培養(yǎng)基再次選取單個(gè)直徑約2 mm菌落比濁至0.5麥?zhǔn)隙龋ㄏ喈?dāng)于1.0×108個(gè)細(xì)菌/mL）備用。

2.2 不同作用時(shí)長(zhǎng)的PEMF 對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

取無(wú)菌12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入2 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；將備用菌液稀釋104倍后加入培養(yǎng)板，每孔加入500 μL。PEMF 組培養(yǎng)皿置于骨生長(zhǎng)刺激儀線圈式換能器中央，開(kāi)啟設(shè)備，使之充分暴露于PEMF；對(duì)照組培養(yǎng)皿置于骨生長(zhǎng)刺激儀線圈式換能器中央，關(guān)閉設(shè)備。所有培養(yǎng)板均置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，每間隔2 h 取培養(yǎng)液倍比稀釋后接種至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h 后計(jì)菌落數(shù)（Colony Forming Unit, CFU）。分別對(duì)2、4、6、8 h 這4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組均重復(fù)6次。

2.3 PEMF與抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的聯(lián)合影響

實(shí)驗(yàn)分4 組，即對(duì)照組、PEMF 組、抗生素組、PEMF+抗生素組。將備用菌液稀釋至105CFU/mL，頭孢呋辛配至0.687 5 μg/mL，取無(wú)菌12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。對(duì)照組與PEMF 組加50 μL 105CFU/mL 菌液、450 μL 生理鹽水以及2 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；抗生素組和PEMF+抗生素組加50 μL 105CFU/mL 菌液、450 μL 0.687 5 μg/mL 抗生素以及2 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；PEMF 組及PEMF+抗生素組培養(yǎng)皿置于骨生長(zhǎng)刺激儀線圈式換能器中央，開(kāi)啟設(shè)備，使之充分暴露于PEMF；對(duì)照組、抗生素組培養(yǎng)皿置于骨生長(zhǎng)刺激儀線圈式換能器中央，關(guān)閉設(shè)備。所有培養(yǎng)板均置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，8 h后取培養(yǎng)液倍比稀釋后接種至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h 后計(jì)菌落數(shù)。每組重復(fù)6次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)上述計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行分析，先進(jìn)行方差齊性判斷，符合正態(tài)分布的測(cè)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用成組樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同作用時(shí)長(zhǎng)的PEMF 對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

2 h與4 h PEMF組與對(duì)照組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。6 h與8 h的PEMF干預(yù)則顯著抑制了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），6 h時(shí)PEMF組菌落計(jì)數(shù)約為對(duì)照組的23%（P<0.001）；8 h時(shí)PEMF組菌落計(jì)數(shù)約為對(duì)照組的28%（P=0.001）。詳見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同PEMF干預(yù)時(shí)長(zhǎng)下金黃色葡萄球菌的細(xì)菌數(shù)（±s）Tab.1 Bacterial count of Staphylococcus aureus under different intervention durations of PEMF(Mean±SD)

表1 不同PEMF干預(yù)時(shí)長(zhǎng)下金黃色葡萄球菌的細(xì)菌數(shù)（±s）Tab.1 Bacterial count of Staphylococcus aureus under different intervention durations of PEMF(Mean±SD)

細(xì)菌數(shù)=菌落數(shù)×倍比稀釋數(shù)

作用時(shí)長(zhǎng)/h 對(duì)照組PEMF組t值P值2 4 6 8 341±33 2 718±661 49 567±5 462 298 333±61 389 315±11 2 567±448 11 650±4 103 83 000±223 334 1.657 0.490 13.192 6.924 0.158 0.644<0.001 0.001

圖1 PEMF不同干預(yù)時(shí)長(zhǎng)哥倫比亞血瓊脂板培養(yǎng)圖片F(xiàn)ig.1 Columbia blood agar plate culture under different intervention durations of PEMF

3.2 PEMF與抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的聯(lián)合影響

經(jīng)倍比稀釋?zhuān)?04倍），對(duì)照組、PEMF組、抗生素組和PEMF+抗生素組菌落計(jì)數(shù)結(jié)果分別為（65.2±11.4）、（21.8±7.9）、（22.8±2.9）、（6.0±2.9）CFU/mL。PEMF組、抗生素組、PEMF+抗生素組菌落計(jì)數(shù)分別是對(duì)照組的32%、34%，10%，都顯著少于對(duì)照組（P<0.05）；同時(shí)PEMF+抗生素組菌落計(jì)數(shù)顯著少于單獨(dú)的PEMF組和抗生素組（P<0.05）（圖2）。

圖2 PEMF與抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的聯(lián)合影響（體外干預(yù)8 h）Fig.2 Synergistic antibacterial effect of PEMF and antibiotics on Staphylococcus aureus(in vitro intervention for 8 hours)

4 討論

感染性骨不連涉及感染和骨不連，多由嚴(yán)重開(kāi)放性骨折所致，感染是骨不連的主要原因。消除感染，促進(jìn)骨折愈合是感染性骨不連治療的目標(biāo)，手術(shù)治療是目前治療感染性骨不連的唯一手段，但其費(fèi)用昂貴，且常需二次手術(shù)治療［1］。作為一種被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的治療技術(shù)，PEMF擁有無(wú)創(chuàng)、溫和、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有希望的骨感染輔助治療方法。

4.1 低能量PEMF的臨床應(yīng)用

能用于臨床治療的PEMF往往是低能低強(qiáng)度的。早在1981年Heckman 等［2］發(fā)現(xiàn)PEMF 可有效促進(jìn)骨折愈合；Garland 等［10］通過(guò)對(duì)139 名骨不連患者的長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)每天至少3 h的PEMF治療，患者骨不連愈合率約為80%。林通等［11］發(fā)現(xiàn)PEMF 聯(lián)合雙膦酸鹽及鈣劑治療老年骨質(zhì)疏松癥在止痛及增加骨密度值方面有更好的療效。有研究表明PEMF 可通過(guò)對(duì)一氧化氮信號(hào)傳導(dǎo)的PEMF 效應(yīng)來(lái)控制傷口中內(nèi)源性IL-1β 的動(dòng)力學(xué)，從而通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的抗炎途徑來(lái)減少術(shù)后的疼痛和麻醉藥的使用［12-14］；潘云虎等［15］通過(guò)對(duì)糖尿病大鼠急性下肢缺血模型的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PEMF 可通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放FGF-2促進(jìn)糖尿病大鼠急性下肢缺血的血管新生。Kwan等［16］的一項(xiàng)臨床隨機(jī)對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)PEMF 可能改善微循環(huán)，從而促進(jìn)慢性糖尿病足潰瘍的傷口愈合。低能量PEMF 在治療骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨折愈合、減少術(shù)后疼痛以及改善微循壞方面均有一定的積極作用。此外，亦有不少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEMF有促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)的功能，但缺少相應(yīng)的臨床研究報(bào)導(dǎo)支持［17-18］。

4.2 高能量PEMF的殺菌應(yīng)用

目前關(guān)于PEMF 對(duì)細(xì)菌作用的研究主要集中在污水處理、食品消毒領(lǐng)域，其所采用的PEMF 為高能高強(qiáng)度電磁場(chǎng)，并不能應(yīng)用于人體。如Piyadasa等［19］研究發(fā)現(xiàn)商用水處理器所產(chǎn)生的PEMF 可導(dǎo)致細(xì)菌活力和培養(yǎng)能力下降；李梅等［20］發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度的PEMF 暴露使細(xì)胞表面發(fā)生了不可修復(fù)的破損現(xiàn)象，造成細(xì)菌正常功能的喪失；張咪［21］發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度脈沖磁場(chǎng)可有效殺滅食品中的李斯特菌，并認(rèn)為高強(qiáng)度PEMF 的暴露加快了鈣離子的跨膜運(yùn)動(dòng),胞內(nèi)鈣離子濃度的升高導(dǎo)致了李斯特菌的死亡。

4.3 低能量PEMF的殺菌作用

與已有報(bào)導(dǎo)的高能量PEMF殺菌報(bào)導(dǎo)不同，本研究采用可供臨床應(yīng)用的低能量PEMF，發(fā)現(xiàn)低能量的PEMF 也同樣具有殺菌作用。研究結(jié)果表明2 h和4 h 的PEMF 干預(yù)組計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該時(shí)期的細(xì)菌處于遲緩期，是細(xì)菌對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程，代謝活躍但分裂緩慢；而6 h與8 h的PEMF干預(yù)則顯著抑制了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，此時(shí)期的細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，該時(shí)期細(xì)菌大小、形態(tài)、染色、生物活性都很典型，對(duì)外界環(huán)境因素的作用敏感［22］。現(xiàn)有研究表明不同電磁場(chǎng)的脈沖個(gè)數(shù)、持續(xù)時(shí)間、頻率都是可變的，這些因素可能導(dǎo)致微生物失活的不可逆電穿孔機(jī)制，如電解和釋放幾種自由基，從而導(dǎo)致單獨(dú)或與電場(chǎng)聯(lián)合殺滅微生物［23］。同樣，細(xì)菌膜電位也會(huì)隨著PEMF的干預(yù)而發(fā)生改變，使細(xì)菌的代謝狀態(tài)發(fā)生根本性的生物學(xué)變化［24］，這一變化可能促使細(xì)菌膜的損傷，影響細(xì)菌增殖［25］。此外，本研究還表明PEMF 與抗生素具有協(xié)同抗菌作用。Pilla 等［26］研究發(fā)現(xiàn)在PEMF作用下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，導(dǎo)致Ca2+與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合增加以及與新陳代謝、炎癥、細(xì)胞凋亡等相關(guān)的下游信號(hào)通路增多?？梢?jiàn)，與藥物療法不同，PEMF 干預(yù)很可能通過(guò)幾個(gè)生物級(jí)聯(lián)而不是一個(gè)狹窄的信號(hào)通路發(fā)揮作用。我們也因此猜想PEMF 與抗生素之間不僅僅是單方面抑菌作用的疊加，二者之間可能也存在相互的作用。另一方面，有文獻(xiàn)報(bào)道PEMF的干預(yù)可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮是為數(shù)不多的已知的氣體信號(hào)分子之一，具有擴(kuò)張血管、減輕炎癥的作用［27］。由于感染的骨組織血供受到破壞，因此骨組織中抗生素的濃度往往達(dá)不到最低殺菌濃度，因此單純使用抗生素治療骨感染效果往往不理想［28］，一氧化氮的擴(kuò)血管作用可改善局部的微循環(huán)，從而提高局部抗生素濃度。所以我們猜想在體內(nèi)，PEMF 與抗生素的協(xié)同抑菌作可能優(yōu)于體外。

本研究也存在一定的局限性。PEMF 療法影響生物學(xué)的生物物理和細(xì)胞機(jī)制是復(fù)雜的，仍需進(jìn)一步深入研究。此外，本研究?jī)H選取了骨感染中最常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌，PEMF 對(duì)于骨感染中其它相關(guān)細(xì)菌是否同樣存在抑制作用，值得進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)低能量PEMF 可以顯著抑制對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期金黃色葡萄球菌，同時(shí)與抗生素之間具有協(xié)同抑菌作用，另一方面，PEMF 對(duì)促進(jìn)骨折愈合、減少術(shù)后疼痛以及改善微循壞均有一定的積極作用，可應(yīng)用于臨床。因此，PEMF 是一種很有希望的骨感染輔助治療方法。