張紅娟，種麗穎，馬寧

(河西學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 張掖，734000)

葡萄是全球栽培最廣的水果之一。國(guó)際葡萄與葡萄酒組織(OIV)最新報(bào)告顯示，2018年全球葡萄栽培面積約為744萬(wàn)hm2，中國(guó)葡萄栽培面積約87.5萬(wàn)hm2，含釀酒葡萄、鮮食葡萄和制干葡萄等。葡萄栽培過(guò)程伴隨著大量副產(chǎn)物的產(chǎn)生，一個(gè)生長(zhǎng)周期修剪廢棄物量約達(dá)1～7.5 t/hm2[1]，主要有葡萄葉、卷須、莖等，此類(lèi)副產(chǎn)物多被丟棄、焚燒或堆肥，這些處理方式既浪費(fèi)資源，也污染環(huán)境。

近年來(lái)已有研究者開(kāi)始關(guān)注這類(lèi)副產(chǎn)物的經(jīng)濟(jì)實(shí)用性，在法國(guó)、西班牙、希臘等部分歐洲國(guó)家，葡萄葉被用于制藥、化妝品、茶葉和其他食品供應(yīng)[2]，土耳其更是有鮮食或腌漬食用葡萄葉的飲食文化[3]，我國(guó)亦是有將葡萄葉入藥，用以止血、鎮(zhèn)痛的中醫(yī)療法[4]。故而充分挖掘此類(lèi)廢棄物價(jià)值，回收再利用，這對(duì)葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展及改善環(huán)境十分有意義。本文在閱讀近10年國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)總結(jié)了葡萄葉中黃酮醇、黃烷醇、酚酸、芪類(lèi)物質(zhì)等多酚化合物組分、常用的提取方法、葡萄葉提取物在體內(nèi)外的抗氧化活性、抑菌效果等生物活性方面的研究成果，以期為葡萄葉片的開(kāi)發(fā)利用提供參考資料。

1 葡萄葉中多酚類(lèi)化合物種類(lèi)

健康葡萄葉中總酚濃度可達(dá)27.5～76.0 g GAE/kg DW(其中GAE表示沒(méi)食子酸當(dāng)量，DW表示葡萄葉干重)，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌及神經(jīng)保護(hù)等多種功效[5]。經(jīng)超高效液相色譜-電噴霧離子源-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)技術(shù)[5]、高效液相色譜-紫外二級(jí)管陣列-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)技術(shù)[6]等檢測(cè)鑒定發(fā)現(xiàn)，葡萄葉中酚類(lèi)化合物主要是黃酮醇類(lèi)、黃烷醇類(lèi)、酚酸類(lèi)及少量的芪類(lèi)物質(zhì)。

1.1 黃酮醇及其衍生物

黃酮醇是葡萄葉中含量最為豐富的一類(lèi)酚類(lèi)化合物，具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，葉脈中含量可達(dá)0.8～7.7 g/kg DW，葉片(除葉脈)中為3.6～20.6 g/kg DW[7]。遇外界刺激時(shí)，參與黃酮類(lèi)物質(zhì)合成的相關(guān)基因(CHS3、F3`5`H、F3H1、LDOX、LAR1及MybA1等)表達(dá)量迅速上調(diào)，導(dǎo)致黃酮醇含量增加[8]。

葡萄葉中鑒定出的黃酮醇類(lèi)多酚主要包括槲皮素、山奈酚、楊梅酮等(表1)。受類(lèi)黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化影響，葡萄葉中黃酮醇物質(zhì):R3位上羥基易與3-O-葡萄糖苷、3-O-葡萄糖苷酸、3-O-半乳糖苷、3-O-鼠李糖苷及3-O-蕓香苷等結(jié)合，同時(shí)有單體形式、糖苷形式存在。其中以槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸含量最高，約占黃酮醇總量的60%～92%，其次是槲皮素-3-O-葡萄糖苷，占黃酮醇總量的2.3%～23.5%[7]。

1.2 黃烷-3-醇及其衍生物

黃烷-3-醇具有與黃酮醇類(lèi)似的C6-C3-C6母環(huán)結(jié)構(gòu)，是黃烷醇類(lèi)物質(zhì)的基本單元。葡萄葉片(除葉脈)中黃烷-3-醇含量為0.44～3.39 g/kg DM，葉脈中為0.04～1.55 g/kg DM[7]。根據(jù)黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)式B環(huán)上的取代基不同及C環(huán)手性碳原子的存在，可分為兒茶素、表兒茶素和培兒茶素、表培兒茶素(表2)。當(dāng)C3位羥基被沒(méi)食子酸酯化后，可形成(表)兒茶素沒(méi)食子酸酯和(表)培兒茶素沒(méi)食子酸酯[13]。葡萄葉中以?xún)翰杷睾孔钬S富，約0.12～4.68 g/kg，而表兒茶素含量相對(duì)較低，僅為0.005～0.15 g/kg，可能是表兒茶素多以復(fù)雜的聚合體形式存在[14]。SCHOEDL等[15]發(fā)現(xiàn)葡萄基葉中的兒茶素濃度顯著高于半葉和頂葉，而表兒茶素沒(méi)食子酸酯和表兒茶素則在頂葉中含量最高，表明葡萄葉位置對(duì)黃烷醇物質(zhì)的含量有較大的影響。

表1 葡萄葉中主要的黃酮醇物質(zhì)及其結(jié)構(gòu)Table 1 Structures of favonols in grapevine leaves

表2 葡萄葉中主要的黃烷-3-醇物質(zhì)及其結(jié)構(gòu)Table 2 Structures of favan-3-ols in grapevine leaves

1.3 酚酸及其衍生物

酚酸是葡萄葉中最豐富的非黃酮類(lèi)物質(zhì)，包括有C6-C1結(jié)構(gòu)的羥基苯甲酸和具有C6-C3結(jié)構(gòu)的羥基肉桂酸。葡萄葉中主要的羥基苯甲酸有沒(méi)食子酸、鞣花酸、原兒茶酸、龍膽酸、丁香酸、香草酸、對(duì)羥基苯甲酸等(表3)，其中，鞣花酸含量最高，約0.14～0.79 g/kg，龍膽酸(0.000 6～0.008 9 g/kg)含量最低[5]。鑒定出的羥基肉桂酸主要有咖啡酸、咖啡酰酒石酸、對(duì)香豆酸、對(duì)香豆酰酒石酸、綠原酸、阿魏酸、芥子酸等(表3)，以綠原酸濃度最高，為0.002 3～0.66 g/kg(平均0.286 g/kg)，其次是咖啡酸(平均濃度約0.043 g/kg)[17]。

1.4 芪類(lèi)及其衍生物

表3 葡萄葉中主要的酚酸物質(zhì)及其結(jié)構(gòu)Table 3 Structures of phenolic acids in grapevine leaves

2 葡萄葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的提取

目前常用于葡萄葉片酚類(lèi)化合物提取的方法主要有傳統(tǒng)溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法和超臨界CO2萃取法等。

溶劑提取法是根據(jù)各化學(xué)組分在溶劑中的溶解性差異，選用對(duì)活性成分溶解度大、對(duì)不需要溶出成分溶解度小的溶劑，從而將有效成分從植物組織內(nèi)溶解出來(lái)。該方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，使用普遍，但提取得率較低。羅英花等[29]研究發(fā)現(xiàn)影響美洲葡萄葉總酚提取率的工藝因素依次為：乙醇濃度>浸提時(shí)間>浸提溫度>料液比，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、浸提時(shí)間60 min、浸提溫度70 ℃、料液比1∶15時(shí)，總酚提取率最高(1.72%)。而張縱圓等[30]研究表明對(duì)葡萄葉黃酮提取率影響最大的是乙醇體積分?jǐn)?shù)，其次為提取溫度。當(dāng)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、提取溫度60 ℃、固液比為1∶40、回流提取2 h時(shí)，葡萄葉黃酮提取量最高，達(dá)5.33 g/kg。王周利等[31]認(rèn)為不同的提取溶劑亦會(huì)對(duì)葡萄葉總酚和白藜蘆醇提取效果造成顯著影響，50%甲醇溶液提取所得總酚濃度最大(34.9 g/kg)，β-環(huán)糊精溶液提取所得次之(16.7 g/kg)，而水提物中多酚濃度最低，僅12.1 g/kg。但β-環(huán)糊精的疏水性空腔可以容納白藜蘆醇分子，并通過(guò)氫鍵的形成維持復(fù)合物的穩(wěn)定，所以β-環(huán)糊精溶液提取葡萄葉中白藜蘆醇效果明顯強(qiáng)于水和甲醇溶液，當(dāng)提取條件為β-環(huán)糊精溶液質(zhì)量濃度為28 g/L，提取溫度為50 ℃，處理時(shí)間68 min時(shí)，白藜蘆醇提取量最大，約0.15 g/kg。

為解決傳統(tǒng)溶劑提取法提取得率低的缺點(diǎn)，常采用超聲波提取、微波提取、酶解提取等輔助提取技術(shù)。孫磊磊等[32]發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，固液比為1∶26，提取溫度56 ℃，提取時(shí)間為59 min，超聲功率280 W時(shí)，白藜蘆醇提取量最大，為16.26 g/kg，比有機(jī)溶劑高14%。程玉[33]研究表明乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取溫度80 ℃，固液比1∶50，超聲處理10 min，浸提4 h時(shí)，葡萄葉中總黃酮提取量為35.03 g/kg DM。庫(kù)爾班江·巴拉提等[34]研究發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的索氏提取法相比，超聲波輔助提取法具有提取效率高，提取時(shí)間短，當(dāng)料液比為1∶30，提取溫度為50 ℃，超聲時(shí)間為45 min，超聲功率150 W時(shí)，葡萄葉乙酸乙酯提取液的抑菌效果最好，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑可達(dá)1.81 cm。孫磊磊[35]采用微波輔助法提取葡萄葉中的白藜蘆醇，其最佳工藝條件為：料液比1∶92，微波時(shí)間76 s，微波功率640 W，在此條件下提取白藜蘆醇為13.52 g/kg。相較于超聲波(16.26 g/kg)和酶提取法(16.45 g/kg)，微波輔助提取獲得的白藜蘆醇量最低，但其提取時(shí)間最短。

圖1 葡萄葉中主要的芪類(lèi)物質(zhì)及其結(jié)構(gòu)[28]Fig.1 Structures of stilbenes in grapevine leaves

超臨界CO2萃取是一種新型的萃取分離技術(shù)。超臨界流體具有高密度、高擴(kuò)散系數(shù)等特殊的物理性質(zhì)，通過(guò)微調(diào)CO2流體在超臨界狀態(tài)下的壓力和溫度，即可改變其對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的溶解性，從而達(dá)到分離的目的。超臨界CO2萃取技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速，提取得率和純度亦高于傳統(tǒng)溶劑提取法[36]。OGANESYANTS等[37]利用超臨界CO2萃取技術(shù)提取分析了葡萄葉中總酚和白藜蘆醇等活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)超臨界CO2萃取液中生育酚濃度(0.046 g/L)極顯著高于溶劑提取液(微量)，白藜蘆醇濃度(0.442 g/L)約為溶劑提取液(0.22 g/L)的2倍。由于超臨界CO2萃取方法對(duì)于極性大的物質(zhì)提取率較低，OGANESYANTS等[37]采用高度濃縮泉水萃取方法從超臨界CO2萃取后的殘留原料中提取出了豐富的多酚物質(zhì)，總酚濃度可達(dá)16.37 g trolox/L，約為超臨界CO2萃取液的4倍，傳統(tǒng)溶劑提取液的30倍，白藜蘆醇濃度(0.444 g/L)與超臨界CO2萃取液相近。

3 葡萄葉酚類(lèi)物質(zhì)的生物活性

3.1 抗氧化活性

植物多酚結(jié)構(gòu)中的酚羥基可與環(huán)境中的分子氧結(jié)合，被氧化成醌，同時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基、金屬離子等十分敏感，可快速捕捉，故而表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性[38]。

黑皮諾葡萄葉具有很高的抗氧化能力(24.02 mol TE/kg FW)，可與紅甘藍(lán)媲美(25.91 mol TE/kg FW)，高于草莓(18.46 mol TE/kg FW)和樹(shù)莓(18.25 mol TE/kg FW)[39]。葡萄葉抗氧化活性與總酚含量和類(lèi)黃酮含量呈顯著正相關(guān)(相關(guān)性可達(dá)90.3%和84.9%)，BA等[40]研究發(fā)現(xiàn)葡萄葉所含總酚(16.37 g GAE/kg)和總黃酮濃度(9.32 g CE/kg)顯著高于柑橘、桑葚、大豆、蕁麻、櫻桃及食用甜菜等植物葉片，表現(xiàn)出很高的抗氧化活性，約為桑葚葉片和大豆葉片抗氧化活性的30倍左右(DPPH法)。

DANI等[11]發(fā)現(xiàn)大鼠腦脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化程度與攝入的葡萄葉提取物中多酚類(lèi)化合物水平呈顯著負(fù)相關(guān)。研究表明，葡萄葉提取物能有效清除NO-自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基等[41]，增加細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，抑制丙二醛合成[42]，亦可抑制天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酰轉(zhuǎn)移酶2種酶濃度增加，減輕細(xì)胞中脂肪和蛋白氧化[43]。

3.2 抑菌活性

葡萄葉提取物中含有豐富的白皮杉醇、反式-白藜蘆醇、反式-ε-葡萄素、(+)-蛇葡萄素A、(+)-蛇葡萄素F、2-γ-葡萄素和Amuresin G 等多酚化合物[22]，可有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)、革蘭氏陰性菌(G-)及真菌類(lèi)微生物。

3.3 抗腫瘤活性

3.4 抗炎活性

紅葡萄葉含有豐富的花青素和黃酮類(lèi)多酚。SANGIOVANNI 等[46]在2種體外胃和腸道炎癥模型中研究了紅葡萄葉水提物的抗炎活性，發(fā)現(xiàn)紅葡萄葉提取物可通過(guò)干擾腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的核因子轉(zhuǎn)錄和核轉(zhuǎn)錄，從而抑制白細(xì)胞介素-8分泌和表達(dá)。當(dāng)葡萄葉提取物經(jīng)胃腸消化后，花青素含量急劇下降(-71%)，導(dǎo)致對(duì)白細(xì)胞介素-8分泌的抑制作用減弱；而槲皮素糖苷含量相對(duì)穩(wěn)定，故而可認(rèn)為槲皮素糖苷物質(zhì)在腸胃水平上的抗炎作用比花青素顯著。葡萄葉甲醇提取物可緩解卡拉膠和組胺誘導(dǎo)的大鼠足跖水腫，當(dāng)提取液質(zhì)量濃度為0.4 g/kg時(shí)，對(duì)卡拉膠和組胺誘導(dǎo)的大鼠足跖水腫抑制率分別為52.63%和54.67%，其抗炎效果與雙氯芬酸鈉接近[47]。

此外，葡萄葉提取物還具有神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)痛、舒緩支氣管擴(kuò)張、抗糖尿病等功效[48]。

4 展望

葡萄葉富含白藜蘆醇等芪類(lèi)化合物及其衍生物、酚酸及其衍生物、黃酮類(lèi)化合物及其衍生物，有很大的開(kāi)發(fā)利用潛質(zhì)。是故繼續(xù)研究葡萄葉中活性成分的分離純化技術(shù)，以利于工業(yè)生產(chǎn)可作為未來(lái)研究方向之一。葡萄葉多酚提取物的抗氧化、抑菌、抗腫瘤等功效已被部分學(xué)者證明，但多數(shù)為體外研究，對(duì)于其體內(nèi)作用效果及機(jī)理研究甚少。這一方向也可作為未來(lái)的研究熱點(diǎn)。葡萄葉在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化應(yīng)用是本領(lǐng)域研究的最終目的。