許剛，卜珊珊，王修身，葛紅

0 引言

肝癌是一種臨床常見的惡性腫瘤，治療手段主要包括手術(shù)、肝動(dòng)脈栓塞化療、介入治療、射頻消融及免疫治療等[1-2]。由于早期技術(shù)水平限制，放療在肝癌的治療中發(fā)揮作用較小。隨著三維適形放療、調(diào)強(qiáng)放療及立體定向放療等技術(shù)的不斷進(jìn)步，放療漸漸成為了一種有效的肝癌治療手段，尤其是立體定向放療的開展，為小肝癌患者提供了一種新的治療途徑[3-5]。

cyclin G1是細(xì)胞色素家族的一員，許多研究證實(shí)cyclin G1在多種腫瘤中表達(dá)異常，是一種癌基因，參與了放療誘導(dǎo)的G2/M期細(xì)胞周期阻滯[6]，同時(shí)也是抑癌基因p53的靶點(diǎn)之一。我們前期研究表明cyclin G1與肝癌細(xì)胞的放射敏感度相關(guān)，抑制cyclin G1的表達(dá)可以提高肝癌細(xì)胞的放療敏感度[7]。本文主要探討了cyclin G1在肝癌組織中的表達(dá)情況及cyclin G1的表達(dá)與肝癌患者放療療效之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年6月至2018年5月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的68例接受放射治療的原發(fā)性肝癌患者，均經(jīng)活檢穿刺病理證實(shí)，所有患者均為肝細(xì)胞癌。其中男31例、女37例；年齡32～73歲，中位年齡62歲；病灶直徑≤5 cm者37例、>5 cm者31例；病灶個(gè)數(shù)≤3個(gè)36例、>3個(gè)32例；無(wú)門脈癌栓22例、有門脈癌栓46例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期16例、Ⅲ～Ⅳ期52例；甲胎蛋白≤400 ng/ml 26例，>400 ng/ml42例；肝功能分級(jí)：Child A級(jí)31例，Child B級(jí)37例；無(wú)乙肝24例、有乙肝44例；未行肝動(dòng)脈栓塞化療術(shù)（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）28例、行TACE術(shù)40例；未口服索拉非尼30例、口服索拉非尼38例；ECOG評(píng)分0分27例、1分 41例。

1.2 放射治療

所有患者均采用調(diào)強(qiáng)放療，CT模擬定位，掃描層厚3 mm，傳輸圖像至計(jì)劃系統(tǒng)，在定位CT圖像上勾畫大體腫瘤靶區(qū)（gross tumor volume,GTV），GTV包括肝臟病灶和/或門靜脈癌栓，周圍外擴(kuò)1 cm形成計(jì)劃靶區(qū)（planning target volume,PTV）。根據(jù)腫塊大小及肝臟耐受程度，給予處方劑量50～60 Gy，分次劑量2 Gy。同時(shí)根據(jù)病灶情況及疾病分期，聯(lián)合應(yīng)用TACE術(shù)和（或）索拉非尼治療。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

將肝癌患者的活檢癌組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，切成4 μm切片，對(duì)切片進(jìn)行脫蠟和水合處理。然后將載玻片浸入0.01 m檸檬酸緩沖液（pH6.0）中并微波加熱誘導(dǎo)進(jìn)行抗原修復(fù)。一抗選擇小鼠單克隆抗人cyclin G1抗體（1:500，美國(guó) Invitrogen公司），二抗選擇辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠抗體。根據(jù)cyclin G1染色的范圍和強(qiáng)度進(jìn)行免疫組織化學(xué)量化評(píng)分，cyclin G1表達(dá)強(qiáng)度分為：0為陰性；1為弱；2為中度；3為高；4為強(qiáng)。細(xì)胞染色程度分級(jí)為：0:陰性；1:1%～25%；2:26%～50%；3:51%～75%；4:76%～100%。將兩個(gè)分?jǐn)?shù)相加得到每個(gè)樣本的最終得分。

1.4 隨訪

隨訪方式包括門診復(fù)診及電話隨訪。在放療后2年內(nèi)每3月隨訪一次，放療后2～5年，每6月隨訪一次。隨訪內(nèi)容包括血常規(guī)、生化，甲胎蛋白及胸腹部CT，必要時(shí)行PET-CT及骨掃描。末次隨訪時(shí)間為2020年6月15日，中位隨訪時(shí)間44月。共有5例患者失訪，其中cyclin G1高表達(dá)組3例、低表達(dá)組2例，失訪原因?yàn)槲催M(jìn)行門診復(fù)診及電話無(wú)法聯(lián)系。隨訪完成率為92.6%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用卡方檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示?？偵媛始盁o(wú)進(jìn)展生存率采用Kaplan-Meier法計(jì)算，Log rank法檢驗(yàn)差異，多因素分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cycin G1表達(dá)與患者臨床特征的相關(guān)性

68例肝癌患者免疫組織化學(xué)評(píng)分中位數(shù)為6分，據(jù)cyclin G1表達(dá)情況，將接受放療的患者活檢標(biāo)本cyclin G1表達(dá)分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組，≥6分為高表達(dá)，<6分為低表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果見圖1?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示有門脈癌栓、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期及甲胎蛋白>400 ng/ml的患者，cyclin G1表達(dá)水平較高（P<0.05），而與性別、年齡、病灶直徑、病灶數(shù)量及ECOG評(píng)分無(wú)明顯相關(guān)性，見表1。

表1 cyclin G1表達(dá)與肝癌放療患者臨床特征的相關(guān)性分析Table 1 Correlation between cyclin G1 expression and clinical characteristics of HCC patients treated with radiotherapy

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝癌標(biāo)本中cyclin G1的表達(dá)Figure 1 cyclin G1 expression in hepatocellular carcinoma tissues detected by immunohistochemical staining

2.2 cyclin G1表達(dá)與患者總生存率和無(wú)進(jìn)展生存率的關(guān)系

所有接受放療的肝癌患者的1、2及3年的總生存率（overall survival,OS）分別為74.6%、47.8%和21.5%，1、2及3年的無(wú)進(jìn)展生存率（progression-free survival,PFS）分別為73.5%、39.7%和13.2%。cyclin G1低表達(dá)和高表達(dá)兩組患者1、2、3年的生存率分別為80.6%、63.6%、31.4%和69.5%、34.1%、9.1%，無(wú)進(jìn)展生存率分別為80.6%、58.1%、25.8%和67.6%、24.3%、2.7%見圖2，Log rank檢驗(yàn)提示兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。單因素分析顯示門脈癌栓、臨床分期、甲胎蛋白、cyclin G1及聯(lián)合應(yīng)用TACE或索拉非尼與患者總生存率及無(wú)進(jìn)展生存率密切相關(guān)，見表2，將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素代入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析，提示放療聯(lián)合應(yīng)用TACE或索拉非尼是肝癌放療患者總生存率和無(wú)進(jìn)展生存率的良好預(yù)后因素，而cyclin G1高表達(dá)是肝癌患者無(wú)進(jìn)展生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表2 肝癌放療患者臨床特征與總生存率及無(wú)進(jìn)展生存率相關(guān)性的單因素分析Table 2 Univariate analysis of correlation between clinical characteristics and OS,PFS of HCC patients treated with radiotherapy

表3 肝癌放療患者臨床特征與總生存率及無(wú)進(jìn)展生存率相關(guān)性的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of correlation between clinical characteristics and OS and PFS of HCC patients treated with radiotherapy

圖2 cyclin G1表達(dá)與肝癌放療患者OS(A)和PFS(B)的關(guān)系Figure 2 Relation between cyclin G1 expression and OS(A),PFS(B) of HCC patients treated with radiotherapy

3 討論

肝癌起病隱匿，只有很少一部分患者有根治的機(jī)會(huì)，總體治療效果欠佳。近年來(lái)放療在肝癌治療中的作用越來(lái)越重要。一項(xiàng)前瞻性、Ⅱ期、多中心研究顯示TACE聯(lián)合三維適形放療效果較好，放療后12周有23%患者達(dá)到完全緩解，61%的患者部分緩解，2年照射野內(nèi)無(wú)進(jìn)展生存率、總無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率分別為45%、29%和61%[8]。SBRT聯(lián)合TACE在小肝癌治療中取得了較好的療效，完全緩解率可以達(dá)到96%[9]，SBRT和射頻消融的治療效果類似[10]。針對(duì)可手術(shù)合并門靜脈癌栓的肝癌患者，新輔助放療也可以提高總生存期，在一項(xiàng)隨機(jī)開放多中心研究中顯示，新輔助放療聯(lián)合手術(shù)6、12、18和24月的總生存率分別為89.0%、75.2%、43.9%和27.4%，優(yōu)于手術(shù)組的81.7%、43.1%、16.7%和9.4%[11]。

肝癌治療中的預(yù)后因素很多，包括腫瘤大小、腹腔淋巴結(jié)、門脈癌栓以及有無(wú)肝外轉(zhuǎn)移以及綜合性治療手段的應(yīng)用等[12-13]。放療療效的預(yù)測(cè)也有一定的研究，田小強(qiáng)等[14]回顧性分析了45例行放療不可手術(shù)的原發(fā)性肝癌患者，結(jié)果提示腫瘤直徑、血供、腫瘤處方劑量是影響肝癌放療療效的關(guān)鍵因素，腫瘤體積、臨床分期以及是否合并門靜脈癌栓是影響預(yù)后的獨(dú)立因素。與肝癌預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物研究也在進(jìn)行中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種生物標(biāo)志因子與肝癌預(yù)后相關(guān)，如C5L2、NOR1和YTHDF1等[15-17]。本研究中所有患者均接受放療，并不是所有的肝臟病灶都接受放療。根據(jù)具體情況，部分患者肝臟病灶TACE術(shù)后單獨(dú)針對(duì)門脈癌栓行放射治療。單因素分析發(fā)現(xiàn)合并門脈癌栓、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、甲胎蛋白>400 ng/ml及cyclin G1高表達(dá)是肝癌放療的不良預(yù)后因素，放療聯(lián)合應(yīng)用TACE或索拉非尼可以提高療效，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

cyclin G1是細(xì)胞周期蛋白家族中的一員，研究表明cyclin G1在多種實(shí)體瘤中表達(dá)異常增高，以cyclin G1為靶點(diǎn)的治療方式在許多腫瘤中發(fā)揮著很好的抗腫瘤作用，包括胰腺癌、卵巢癌等[18-19]。cyclin G1在肝癌的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。Wen等的研究顯示cyclin G1在肝癌組織中高表達(dá)，并且與肝癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)[20]。我們的前期研究顯示抑制cyclin G1通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2可以上調(diào)肝癌細(xì)胞的放療敏感度[7]。在其他腫瘤中也發(fā)現(xiàn)cyclin G1與腫瘤放療敏感復(fù)有關(guān)，Xu等報(bào)道了沉默熱休克蛋白27通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白G1來(lái)提高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感度[21]。所以cyclin G1高表達(dá)可能與放療耐受有關(guān)，并進(jìn)一步影響放療療效。本研究中發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中cyclin G1的表達(dá)顯著高于癌旁組織，在接受放療的患者中cyclin G1高表達(dá)組的1、2和3年總生存率及無(wú)進(jìn)展生存率明顯低于cyclin G1低表達(dá)組，多因素分析顯示cyclin G1是無(wú)進(jìn)展生存期的獨(dú)立不良預(yù)后因子。

本文回顧性分析cyclin G1在肝癌放療患者中預(yù)后價(jià)值，結(jié)果提示cyclin G1高表達(dá)是肝癌放療患者的不良預(yù)后因素。考慮到本研究是回顧性分析，仍存在一些問題，本研究中所涉及的病例均接受了綜合治療，如TACE及索拉非尼等，臨床病理特征分析顯示兩組患者之間所接受的綜合治療方法無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以一定程度上可以間接反映出cyclin G1在肝癌放療患者的預(yù)后價(jià)值。cyclin G1在肝癌放療中的預(yù)測(cè)價(jià)值，需要前瞻性研究進(jìn)一步證實(shí)。