杜 康， 曹 勇， 劉 彪， 謝 磊， 鄭慧軍

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)， 鄭州 430052；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州 430052)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，主要治療方式為手術(shù)、放化療[1]，但患者5年生存率仍然較低，且副作用較大。已有報(bào)道，夏枯草對(duì)乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤具有良好的治療作用[2，3]，但對(duì)膠質(zhì)瘤的治療作用尚無(wú)研究。本實(shí)驗(yàn)擬考察夏枯草溶液對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖與凋亡的影響。本研究已通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1 材料與方法

1.1 藥物

夏枯草配方顆粒，購(gòu)自四川新綠藥業(yè)有限公司(5 g/盒)

1.2 腫瘤細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱瘤細(xì)胞)購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。雄性小鼠裸鼠，4周齡，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前所有裸鼠(BALB/cA-nu)在無(wú)病毒(SPF)環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫為26 ℃～28 ℃(78～820F)，相對(duì)溫度保持在40%～60%，每日約維持10 h光照，14 h無(wú)光的明暗周期，提供無(wú)菌食物和水(所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，將裸鼠(BALB/cA-nu)按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、夏枯草低、中和高劑量組，在新的環(huán)境中飼養(yǎng)1周。

1.3 試劑

MEM培養(yǎng)基(博士德生物科技有限公司)；Phosphate Buffered Saline(Biological Industries)；胎牛血清(Biological Industries)；青鏈霉素雙抗混合液(Beijing Solarbio)；CCK-8試劑盒(上海同仁化學(xué)科技有限公司)；凋亡試劑盒(凱基生物)；BCA蛋白測(cè)定盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、Ki-67單克隆抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)；mRNA提取試劑盒(上海生工生物有限公司)；Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-9的引物均委托上海生工生物有限公司合成。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱(HERAcell160i-美國(guó)Thermo Scientific HERAcell160i CO2培養(yǎng)箱)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD FACSJazz)；超微量核酸蛋白測(cè)定儀(中國(guó)One Drop 公司 Nano Drop One/One C)；酶標(biāo)儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司 318C)；基因擴(kuò)增儀(美國(guó)BIO-RAD公司 T100)；蛋白凝膠成像系統(tǒng)(BIO RAD Industries ChemiDoc XRS)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 夏枯草溶液的制備 將10 g夏枯草配方顆粒溶于20 ml MEM培養(yǎng)基中超聲波震蕩15 min，4 ℃ 1200 r/min離心10 min，保留上清液，以0.22 μm孔徑的無(wú)菌濾器過(guò)濾，-20 ℃層凍存，夏枯草濃度約為40 mg/ml(生藥/ml)。

1.5.2 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞培養(yǎng) 將膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞放入恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)12 h，以胰酶消化并離心，按1×106個(gè)細(xì)胞密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入MEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，1%青鏈霉素雙抗混合液)4 ml，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2)，待膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底進(jìn)行傳代(約每48～72 h傳1次)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞分組 將膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞接種在96孔板中，將其分為6組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；夏枯草低、中和高劑量組將夏枯草溶液采用培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，使得每孔的終濃度分別為0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml。

1.5.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)夏枯草藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞按照每孔800個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，加入夏枯草低、中和高劑量，5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，結(jié)晶紫溶液染色后于顯微鏡下行各組細(xì)胞集落計(jì)數(shù)。

1.5.5 CCK-8檢測(cè)夏枯草藥物毒性對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，向96孔板中加入夏枯草低、中和高劑量溶液，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。24 h后每孔中加入10 μl CCK-8溶液，10 min后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組在450 nm處的吸光度值。

1.5.6 顯微鏡下對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 各組細(xì)胞培養(yǎng)加藥干預(yù)24 h后，倒盡培養(yǎng)基，采用PBS洗2遍，常溫干燥，采用75%乙醇固定，5%結(jié)晶紫溶液染色2 h，顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)各組細(xì)胞聚集成團(tuán)的個(gè)數(shù)，≥50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)細(xì)胞集落。

1.5.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)U87細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞培養(yǎng)加藥干預(yù)24 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化，按照每管1×105～5×105個(gè)細(xì)胞，收集至2 ml離心管中，2000r/min離心5 min，加入1.5 ml PBS液洗滌細(xì)胞，2000r/min離心5 min，重復(fù)上述洗滌操作2遍。依次加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞、5 μl Annexin V-FITC、5 μL Propidium lodide混勻。室溫下避光反應(yīng)5～15 min，反應(yīng)完成后在1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀對(duì)各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)。

1.5.8 RT-PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡基因的表達(dá) 細(xì)胞加藥干預(yù)24 h后，提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定細(xì)胞總RNA濃度及純度。對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：以1 μg RNA合成的cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參基因，分別擴(kuò)增Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9基因。當(dāng)基因擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)，從65 ℃緩慢加熱至95 ℃，將PCR溶解產(chǎn)物的溶解曲線建立。采用2-△△CT相對(duì)定量法，計(jì)算各組基因的表達(dá)情況，同時(shí)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.9 Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 各組細(xì)胞培養(yǎng)加藥干預(yù)24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量、配置蛋白膠，蛋白上樣電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉，抗體孵育。孵育完成后，將蛋白膜放入ECL發(fā)光液中搖動(dòng)3 min，利用Image Lab系統(tǒng)進(jìn)行曝片，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測(cè)各組Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.5.10 小鼠皮下成瘤模型建立、給藥及指標(biāo)檢測(cè) 將4周大的雄性小鼠裸鼠(BALB/cA-nu)按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、夏枯草低、中和高劑量組4組，分別為1.8 g/kg組、3.6 g/kg組、5.4 g/kg組每組各4只。將U87細(xì)胞(每側(cè)1×106細(xì)胞/100μl)皮下注射到小鼠側(cè)腹。接種后每隔1 d按組別給小鼠灌胃給藥，給藥容積為0.1 ml/10 g，對(duì)照組灌胃給予生理鹽水。每6 d測(cè)量腫瘤大小，持續(xù)30 d(給藥15 d)。使用公式(width2×length)/2計(jì)算腫瘤體積。30 d后對(duì)小鼠實(shí)行安樂(lè)死取皮下瘤，行Ki-67免疫組化染色，Ki-67染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率即為增殖指數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 夏枯草對(duì)瘤細(xì)胞增殖的影響

圖1示，與對(duì)照組比較，夏枯草組的瘤細(xì)胞集落數(shù)量減少、活性降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性降低，說(shuō)明夏枯草可抑制瘤細(xì)胞增殖。

注：A.平板克隆實(shí)驗(yàn)；B.細(xì)胞集落數(shù)量；C.CCK-8檢測(cè)；NC.對(duì)照組；1.夏枯草低劑量組；2.夏枯草中劑量組；3.夏枯草高劑量組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與夏枯草低劑量組比較：%P<0.05；與夏枯草中劑量組比較：&P<0.05

2.2 夏枯草對(duì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

圖2示，對(duì)照組瘤細(xì)胞成團(tuán)約2～3個(gè)，夏枯草低劑量組成團(tuán)約0～1個(gè)，夏枯草中及高劑量組均未見(jiàn)成團(tuán)，隨著夏枯草劑量增加，細(xì)胞數(shù)量有減少趨勢(shì)，表明夏枯草可抑制瘤細(xì)胞增殖。

注：NC.對(duì)照組；1.夏枯草低劑量組；2.夏枯草中劑量組；3.夏枯草高劑量組

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)夏枯草誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡

圖3示，與對(duì)照組比較，夏枯草組的凋亡細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，且劑量呈依賴性增高趨勢(shì)。

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與夏枯草低劑量組比較：%P<0.05；與夏枯草中劑量組比較：&P<0.05；NC.對(duì)照組；1.夏枯草低劑量組；2.夏枯草中劑量組；3.夏枯草高劑量組

2.4 夏枯草對(duì)Bax、Bcl-2、Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、Caspase-9(Cleaved-Caspase-9)及Bcl-2表達(dá)的影響

圖4示，與對(duì)照組比較，夏枯草組的Bax mRNA及蛋白、Caspase-3、Caspase-9 mRNA、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)均增加，Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性趨勢(shì)。夏枯草溶液可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子，如Bax、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9及Bcl-2表達(dá)促進(jìn)瘤細(xì)胞凋亡。

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與夏枯草低劑量組比較：%P<0.05；與夏枯草中劑量組比較：&P<0.05；NC.對(duì)照組；1.夏枯草低劑量組；2.夏枯草中劑量組；3.夏枯草高劑量組

2.5 夏枯草對(duì)在小鼠皮下成瘤的抑制作用

圖5示，與模型組比較，夏枯草組皮下瘤體積均降低，皮下瘤Ki-67表達(dá)及增殖指數(shù)均降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性降低趨勢(shì)。

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與夏枯草低劑量組比較：%P<0.05；與夏枯草中劑量組比較：&P<0.05；MODEL.模型組；1.夏枯草低劑量組；2.夏枯草中劑量組；3.夏枯草高劑量組

3 討論

夏枯草通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞的增殖與遷移，達(dá)到對(duì)多種惡性腫瘤的抗癌效果[4]。本研究分別以瘤細(xì)胞及該細(xì)胞接種的裸鼠為研究對(duì)象，結(jié)果顯示夏枯草可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞及瘤組織的增殖，均呈劑量依賴性關(guān)系，也印證了文獻(xiàn)的觀點(diǎn)。

夏枯草的抗癌機(jī)制較復(fù)雜[5，6]，一是夏枯草提取物可以通過(guò)P53通路促進(jìn)畸胎瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖；二是夏枯草可提高結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶的敏感性，提高結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率；三是夏枯草的乙醇提取液可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)將瘤細(xì)胞與夏枯草低、中和高劑量共培養(yǎng)24 h，夏枯草組的瘤細(xì)胞集落數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞活性降低，凋亡細(xì)胞數(shù)增多，凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)增加，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)降低，凋亡相關(guān)基因Bax、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)均增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，均呈夏枯草劑量依賴性趨勢(shì)。小鼠皮下瘤體積試驗(yàn)示，與模型組比較，夏枯草組皮下瘤體積均降低，皮下瘤Ki-67表達(dá)及增殖指數(shù)均降低，提示夏枯草可用于治療膠質(zhì)瘤，與其所含的有效成分相關(guān)[7-9]。如夏枯草含有大量β-谷甾醇、豆甾醇、菠甾醇及槲皮素且均有明確的抗癌效果，其口服生物利用度≥36%；夏枯草所含的齊墩果酸可調(diào)節(jié)Caspase-3途徑或抑制MAPK/ERK 信號(hào)通路，抑制顱內(nèi)膠質(zhì)瘤增殖、遷移和侵襲。

文獻(xiàn)報(bào)道，將夏枯草注射液用于治療臨床惡性腫瘤患者，提示夏枯草口服難以通過(guò)血腦屏障[10]。劉泰[11]等將夏枯草納入傳統(tǒng)方劑五苓散中，夏枯草具有保護(hù)血腦屏障及消除腦血管源性水腫等效果，提示夏枯草有效成分可穿越血腦屏障。盡管本研究顯示，夏枯草灌胃給藥可降低小鼠皮下成瘤的體積，抑制促瘤蛋白Ki-67表達(dá)及增殖指數(shù)，尚無(wú)明確數(shù)據(jù)證實(shí)膠質(zhì)瘤血腦屏障對(duì)夏枯草發(fā)揮抗癌效果。

夏枯草通過(guò)調(diào)控Bax mRNA及蛋白、Bcl-2 mRNA及蛋白、Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，且呈夏枯草劑量依賴性趨勢(shì)。