付萌，韓建勛, ，宋薇，富玉，張雅莉，李婷

1.譜尼測(cè)試集團(tuán)北京檢驗(yàn)認(rèn)證科學(xué)研究院有限公司（北京 100095）；2.譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司（北京 100095）

苯甲羥肟酸[1-2]是一種金屬絡(luò)合試劑和高效的礦物捕獲劑，然而一些廠家為進(jìn)一步增強(qiáng)面粉的筋度、白度、蓬松度等[3]，在小麥粉或面粉改良劑中非法添加苯甲羥肟酸。研究表明苯甲羥肟酸的大鼠口服致死中量（LD50）大于500 mg/kg，且苯甲羥肟酸是比較難降解的有機(jī)物[4]，對(duì)人類和生態(tài)環(huán)境存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)和危害。原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局[5]多次發(fā)布公告，要求各地嚴(yán)格監(jiān)控面粉質(zhì)量安全，其中苯甲羥肟酸為重點(diǎn)關(guān)注有毒有害物質(zhì)之一。

苯甲羥肟酸的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[6]、紅外光譜法[7-9]、紫外分光光度法[10-11]等，但相關(guān)研究多集中于礦物浮選方面。有研究[12]采用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)定量檢測(cè)面粉改良劑中苯甲羥肟酸的含量，雖然檢測(cè)靈敏度高，但儀器價(jià)格昂貴、普適性較低。高效液相色譜技術(shù)已相當(dāng)成熟，被廣泛應(yīng)用于食品中營(yíng)養(yǎng)成分、有毒有害物質(zhì)等[13-24]各方面的定性定量檢測(cè)，在食品安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要作用。為有效檢測(cè)小麥粉中苯甲羥肟酸含量、避免非法添加威脅人體健康，試驗(yàn)建立一種適用于小麥粉中苯甲羥肟酸的高效液相色譜定量檢測(cè)方法，并與國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布的BJS 202002《小麥粉及其面粉改良劑中苯甲羥肟酸的測(cè)定》補(bǔ)充檢驗(yàn)方法進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

21份小麥粉（市售，樣品信息見表1）。

表1 樣品信息

苯甲羥肟酸（99.0%，Sigma公司）；苯甲酸（99.5%，Sigma公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，北京化工廠）。

Agilent series 1200高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測(cè)器，Agilent公司）；超純水凈化儀（Millipore-Q公司）；AB135-S分析天平（感量0.1 mg，METTLER TOLEDO公司）；Vortex-Genie 2渦旋震蕩器（Scientific Industries公司）；H1850臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘義離心機(jī)儀器有限公司）；KH-500E超聲清洗器（中國(guó)昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；有機(jī)相濾膜（尼龍，0.22 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）；pH精密試紙（pH 0.5～5.0，杭州特種紙業(yè)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取50.00 mg苯甲羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用25 mL 10%（體積比）甲醇/水溶液溶解后定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度1000.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃儲(chǔ)存。標(biāo)準(zhǔn)工作液：用10%（體積比）甲醇/水溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋配制成質(zhì)量濃度0.25，0.50，1.00，5.00和10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理

樣品前處理方法參考文獻(xiàn)[12,25]，并加以改進(jìn)。稱取2.00 g試樣，加入8 mL 60%（體積比）甲醇/水溶液旋渦混勻，超聲提取20 min，按4000 r/min離心3 min；取上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜，上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積50.0 μL；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為磷酸二氫鉀溶液（pH 2.5），梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.2.4 苯甲羥肟酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算

式中：X為目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的目標(biāo)物質(zhì)量濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；1000為換算系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相條件優(yōu)化結(jié)果

試驗(yàn)以甲醇為流動(dòng)相A，以水、不同pH（pH 2.0，2.5，3.0，4.0和5.0）的磷酸二氫鉀溶液分別為流動(dòng)相B。采用pH精密試紙測(cè)定流動(dòng)相A、B混合前后pH的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同比例流動(dòng)相A、B兩相混合時(shí)，混合溶液的pH幾乎不變，因此，可排除流動(dòng)相A、B兩相在混合過程中因pH變化而造成目標(biāo)色譜峰和雜質(zhì)色譜峰保留時(shí)間的改變。

按照1.2.2小節(jié)的方法處理小麥粉樣品，取1 mL濾液，與1 mL 200 μg/mL苯甲羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，上機(jī)檢測(cè)，由儀器自帶數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算目標(biāo)物色譜峰對(duì)稱性及與雜質(zhì)峰的分離度。如圖1和表3所示，以水為流動(dòng)相B，苯甲羥肟酸色譜峰與樣品中雜質(zhì)色譜峰存在部分交叉重合，無法達(dá)到完全分離效果（圖1a）；以磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相B，pH 2.0時(shí)，目標(biāo)物色譜峰與雜質(zhì)色譜峰幾乎完全重合（圖1 b）；pH 2.5～5.0時(shí)，隨著流動(dòng)相pH增加，雜質(zhì)色譜峰保留時(shí)間前移，而苯甲羥肟酸色譜峰保留時(shí)間變化較小，且其對(duì)稱性及與雜質(zhì)色譜峰的分離度降低（圖1 c～f）。由此說明，最佳流動(dòng)相條件是pH 2.5的磷酸二氫鉀溶液。

表3 不同流動(dòng)相對(duì)苯甲羥肟酸和雜質(zhì)分離的影響

圖1 小麥粉中苯甲羥肟酸在不同流動(dòng)相條件下的色譜圖

2.2 提取試劑的優(yōu)化結(jié)果

準(zhǔn)確稱取2.00 g小麥粉樣品，添加10.00 μg苯甲羥肟酸，以不同體積比（0∶1，1∶9，1∶4，3∶7，2∶3，1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1和1∶0）甲醇/水混合溶液按照1.2.2的方法進(jìn)行提取分析，每個(gè)處理3個(gè)平行。由表4和圖2可知，使用不同體積比混合的甲醇/水溶液進(jìn)行提取時(shí)，苯甲羥肟酸回收率不同，差異極顯著（p＜0.01）。其中，采用100%甲醇或100%水進(jìn)行提取時(shí)，苯甲羥肟酸回收率均低于其他比例甲醇/水混合溶液的回收率；甲醇/水體積比3∶2時(shí)，苯甲羥肟酸回收率最高，與其他比例具有顯著性差異。因此，選擇體積比3∶2的甲醇/水混合溶液作為最佳提取試劑。

表4 小麥粉中苯甲羥肟酸在不同提取試劑條件下的回收率方差分析表（α=0.01）

圖2 小麥粉中苯甲羥肟酸在不同提取試劑條件下的回收率

2.3 苯甲酸干擾排除結(jié)果

過氧化苯甲酰[26-27]是一種強(qiáng)氧化劑，常用作面粉處理劑，改善面粉色澤，增加面粉白度，加快面粉后熟，延長(zhǎng)保質(zhì)期，提高出粉率等。過氧化苯甲酰用于面粉漂白后會(huì)分解成苯甲酸。為排除苯甲酸對(duì)方法檢測(cè)苯甲羥肟酸的干擾，按照1.2.3小節(jié)的條件分別測(cè)定10.00 μg/mL苯甲羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和10.00 μg/mL苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果如圖3所示。在相同色譜條件下，苯甲羥肟酸色譜峰保留時(shí)間為16.10 min，苯甲酸色譜峰保留時(shí)間為25.30 min，2種物質(zhì)能完成分開。由此說明，該方法中苯甲羥肟酸的檢測(cè)不會(huì)受苯甲酸干擾。

圖3 苯甲羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（b）色譜圖

2.4 方法有效性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 方法線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果

將0.25，0.50，1.00，5.00和10.00 μg/mL的苯甲羥肟酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.2.3小節(jié)的條件進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。如圖4所示，苯甲羥肟酸在0.25～10.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=148.65x-31.327，R2=0.9995，檢出限（LOD）為1.00 mg/kg，定量限（LOQ）為3.00 mg/kg。

圖4 苯甲羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 方法精密度結(jié)果

以小麥粉陰性樣品作為空白基質(zhì)，將苯甲羥肟酸按質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.00 mg/kg的水平進(jìn)行加標(biāo)。按照1.2.3的條件測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6次檢測(cè)結(jié)果分別為6.04，5.96，6.12，6.12，6.12和5.88 mg/kg，平均值為6.04 mg/kg，SRSD為1.7%（表5），表明該方法的精密度良好。

表5 方法精密度分析結(jié)果

2.4.3 加標(biāo)回收率結(jié)果

以小麥粉陰性樣品作為空白基質(zhì)，將苯甲羥肟酸按質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.00，6.00和30.00 mg/kg進(jìn)行3組水平加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)水平6個(gè)平行，按照1.2.2和1.2.3的方法進(jìn)行測(cè)定分析。由表6可知，小麥粉中加標(biāo)水平為3.00 mg/kg時(shí)，苯甲羥肟酸回收率為91.7%～99.0%，平均回收率為94.7%，SRSD為3.2%；加標(biāo)水平為6.00 mg/kg時(shí)，回收率為90.0%～95.8%，平均回收率為92.8%，SRSD為3.8%；加標(biāo)水平為30.00 mg/kg時(shí)，回收率為90.7%～99.0%，平均回收率為93.3%，SRSD為3.2%。結(jié)果說明試驗(yàn)方法具有較高準(zhǔn)確度。

表6 苯甲羥肟酸加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

因此，以試驗(yàn)方法檢測(cè)小麥粉中苯甲羥肟酸，在0.25～10.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2為0.9995），回收率為90.0%～99.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～3.8%，檢出限（LOD）為1.00 mg/kg，定量限（LOQ）為3.00 mg/kg。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采購(gòu)21份不同產(chǎn)地的小麥粉樣品，其中北京市、山東省、遼寧省各2份，河北省4份，河南省和新疆維吾爾自治區(qū)各3份，黑龍江省、江蘇省、湖南省、四川省、內(nèi)蒙古自治區(qū)各1份。分別使用試驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果經(jīng)試驗(yàn)方法測(cè)定21份小麥粉樣品，所有樣品均未檢出苯甲羥肟酸；使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定，苯甲羥肟酸目標(biāo)色譜峰與雜質(zhì)峰無法分離。

標(biāo)準(zhǔn)BJS 202002中以甲醇為提取試劑，甲醇/0.01%磷酸為流動(dòng)相，測(cè)定小麥粉及小麥粉處理劑中苯甲羥肟酸含量，檢出限為0.1 mg/kg，定量限為0.3 mg/kg。實(shí)驗(yàn)室使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，100%甲醇的提取效率比甲醇/水（體積比3∶2）的混合溶液提取效率低，且在標(biāo)準(zhǔn)方法的流動(dòng)相條件下，苯甲羥肟酸目標(biāo)色譜峰與小麥粉中的雜質(zhì)色譜峰重合，無法進(jìn)行苯甲羥肟酸的準(zhǔn)確定量。與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，試驗(yàn)方法中苯甲羥肟酸含量在0.25～10.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為1.00 mg/kg，定量限為3.00 mg/kg。雖然試驗(yàn)方法的檢出限較標(biāo)準(zhǔn)方法高，但是該方法可有效分離苯甲羥肟酸色譜峰與小麥粉中的雜質(zhì)峰，避免雜質(zhì)峰對(duì)苯甲羥肟酸定量的干擾，具有良好的精確度和準(zhǔn)確度。

此外，鄭紅等[12]建立液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)面粉改良劑中苯甲羥肟酸含量，該方法在0.005～1.000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2＞0.999），方法檢出限為0.01 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg。比較而言，雖然試驗(yàn)方法的檢出限較高，但2種方法適用對(duì)象不同，試驗(yàn)方法適用于小麥粉中苯甲羥肟酸含量的定量測(cè)定，而液相色譜-質(zhì)譜法針對(duì)的是面粉改良劑，2種方法是否通用于小麥粉和面粉改良劑兩類樣品，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，試驗(yàn)方法采用的液相色譜設(shè)備，價(jià)格相對(duì)便宜，普適性較高。

3 結(jié)論

針對(duì)小麥粉中可能添加的苯甲羥肟酸有毒有害物質(zhì)，通過優(yōu)化色譜條件、提取試劑（甲醇/水）體積比，分析苯甲酸干擾性及方法有效性等，最終建立一種可定量檢測(cè)小麥粉中苯甲羥肟酸含量的高效液相色譜法。該方法可有效分離苯甲羥肟酸與小麥粉中的雜質(zhì)，具有良好的精確度和準(zhǔn)確度，苯甲羥肟酸在0.25～10.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為1.00 mg/kg，定量限為3.00 mg/kg。對(duì)21份不同產(chǎn)地的小麥粉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均未檢出苯甲羥肟酸成分。該方法前處理簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，靈敏度及回收率較高，可滿足苯甲羥肟酸的定性定量檢測(cè)要求。該方法的建立為中國(guó)小麥粉的質(zhì)量控制和安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。